Name: Un sistema di co-coltura modificato per la comprensione delle interazioni tra granulosa e cellule dellarca nellovaio bovino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri un sistema di co-coltura modificato per studiare le interazioni tra cellule della teca e della granulosa nell'ovaio bovino. Questo modello riproduce l'ambiente in vivo per analizzare la segnalazione paracrina.

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<ol><li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Forde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrous+cycles+in+Bos+taurus+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrous cycles in Bos taurus cattle.</a> Anim Reprod Sci. 124 (3-4), 163-169 (2011).</li>
<li>Hennet, M. L., Combelles, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antral+follicle%3A+A+microenvironment+for+oocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The antral follicle: A microenvironment for oocyte differentiation.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 819-831 (2012).</li>
<li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+resource%3A+Preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Research resource: Preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Mol Endocrinol. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell Tissue Res. 354, 869-880 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue+culture+model+of+estrogen-producing+primary+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells.</a> J Vis Exp. (139), e58208(2018).</li>
<li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system%3A+Induction+and+maintenance+of+estradiol+production%2C+response+to+follicle-+stimulating+hormone%2C+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biol Reprod. 56 (3), 608-616 (1997).</li>
<li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androstenedione+increases+cytochrome+P450+aromatase+messenger+ribonucleic+acid+transcripts+in+non-luteinizing+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Androstenedione increases cytochrome P450 aromatase messenger ribonucleic acid transcripts in non-luteinizing bovine granulosa cells.</a> Mol Reprod Dev. 70, 175-183 (2005).</li>
<li>Chandrasekher, Y. A., Fortune, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxytocin+on+steroidogenesis+by+bovine+theca+and+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxytocin on steroidogenesis by bovine theca and granulosa cells.</a> Endocrinology. 127 (2), 926-933 (1990).</li>
<li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 62 (1), 186-191 (2000).</li>
<li>Gong, J. G., McBride, D., Bramley, T. A., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+recombinant+bovine+somatotrophin%2C+insulin-like+growth+factor-I+and+insulin+on+bovine+granulosa+cell+steroidogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of recombinant bovine somatotrophin, insulin-like growth factor-I and insulin on bovine granulosa cell steroidogenesis in vitro.</a> J Endocrinol. 143 (1), 157-164 (1994).</li>
<li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-lactate+induces+specific+genome-wide+alterations+of+gene+expression+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">L-lactate induces specific genome-wide alterations of gene expression in cultured bovine granulosa cells.</a> BMC Genomics. 20 (1), 273(2019).</li>
<li>Baddela, V. S., Sharma, A., Plinski, C., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+protects+granulosa+cells+from+oleic+acid+induced+steatosis+and+rescues+progesterone+production+via+cAMP+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Biol+Lipids%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid protects granulosa cells from oleic acid induced steatosis and rescues progesterone production via cAMP dependent mechanism.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1867 (8), 159159(2022).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+free+fatty+acids+affect+bovine+granulosa+cell+function%3A+a+molecular+cue+for+compromised+reproduction+during+negative+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Connect%22%5BJournal%5D)">Elevated free fatty acids affect bovine granulosa cell function: a molecular cue for compromised reproduction during negative energy balance.</a> Endocr Connect. 8 (5), 493-505 (2019).</li>
<li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+oestrogen+synthesis+-+The+two-cell%2C+two-+gonadotrophin+model+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Follicular oestrogen synthesis - The two-cell, two- gonadotrophin model revisited.</a> Mol Cell Endocrinol. 100, 51-54 (1994).</li>
<li>Campen, K. A., Lavallee, M., Combelles, C. M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bisphenol+S+on+bovine+granulosa+and+theca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">The impact of bisphenol S on bovine granulosa and theca cells.</a> Reprod Domest Anim. 53 (2), 450-457 (2018).</li>
<li>Glister, C., Richards, S. L., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+%28BMP%29+-4%2C+-6%2C+and+-7+potently+suppress+basal+and+luteinizing+hormone-induced+androgen+production+by+bovine+theca+interna+cells+in+primary+culture%3A+could+ovarian+hyperandrogenic+dysfunction+be+caused+by+a+defect+in+thecal+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins (BMP) -4, -6, and -7 potently suppress basal and luteinizing hormone-induced androgen production by bovine theca interna cells in primary culture: could ovarian hyperandrogenic dysfunction be caused by a defect in thecal BMP signaling.</a> Endocrinology. 146 (4), 1883-1892 (2005).</li>
<li>Wrathall, J. H., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibin-related+peptides+and+oestradiol+on+androstenedione+and+progesterone+secretion+by+bovine+theca+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibin-related peptides and oestradiol on androstenedione and progesterone secretion by bovine theca cells in vitro.</a> J Endocrinol. 145 (3), 491-500 (1995).</li>
<li>Shores, E. M., Picton, H. M., Hunter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+pig+theca+cell+steroidogenesis+by+LH%2C+insulin-like+growth+factor+I+and+granulosa+cells+in+serum-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of pig theca cell steroidogenesis by LH, insulin-like growth factor I and granulosa cells in serum-free culture.</a> J Reprod Fertil. 118 (2), 211-219 (2000).</li>
<li>Gregoraszczuk, E. L., Ptak, A., Karniewska, M., Ropstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+defined+mixtures+of+PCBs%2C+p%2Cp%27-DDT+and+its+metabolite+p%2Cp%27-DDE%2C+on+co-culture+of+porcine+theca+and+granulosa+cells%3A+steroid+secretion%2C+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Action of defined mixtures of PCBs, p,p'-DDT and its metabolite p,p'-DDE, on co-culture of porcine theca and granulosa cells: steroid secretion, cell proliferation and apoptosis.</a> Reprod Toxicol. 26 (2), 170-174 (2008).</li>
<li>Rak, A., Drwal, E., Wróbel, A., Gregoraszczuk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistin+is+a+survival+factor+for+porcine+ovarian+follicular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Resistin is a survival factor for porcine ovarian follicular cells.</a> Reproduction. 150 (4), 343-355 (2015).</li>
<li>Kotsuji, F., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The role of granulosa and theca cell interactions in ovarian structure and function.</a> Microsc Res Tech. 27 (2), 97-107 (1994).</li>
<li>Orisaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+granulosa+cell+differentiation+during+gonadotropin-independent+follicular+growth+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on granulosa cell differentiation during gonadotropin-independent follicular growth in cattle.</a> Mol Reprod Dev. 73 (6), 737-744 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of granulosa and theca cell interactions in ovarian follicular maturation.</a> Microsc Res Tech. 69 (6), 450-458 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+apoptosis+and+proliferation+of+granulosa+cells%3A+changes+during+bovine+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on apoptosis and proliferation of granulosa cells: changes during bovine follicular maturation.</a> Biol Reprod. 66 (6), 1635-1639 (2002).</li>
<li>Allegrucci, C., Hunter, M. G., Webb, R., Luck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bovine+granulosa+and+theca+cells+in+a+novel+serum-free+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interaction of bovine granulosa and theca cells in a novel serum-free co-culture system.</a> Reproduction. 126 (4), 527-538 (2003).</li>
<li>Santaguida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+by+side+comparison+between+dynamic+versus+static+models+of+blood-brain+barrier+in+vitro%3A+A+permeability+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: A permeability study.</a> Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolated+Brain+Microvessel%3A+A+Versatile+Experimental+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Isolated Brain Microvessel: A Versatile Experimental Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Front Physiol. 11, 398(2020).</li>
<li>Schneider, F., Brüssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reprod Fertil Dev. 18 (8), 857-866 (2006).</li>
<li>Nimz, M., Spitschak, M., Schneider, F., Fürbass, R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+genes+encoding+steroidogenic+enzymes+and+hormone+receptors+in+late+preovulatory+follicles+of+the+cow+coincides+with+an+accumulation+of+intrafollicular+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of genes encoding steroidogenic enzymes and hormone receptors in late preovulatory follicles of the cow coincides with an accumulation of intrafollicular steroids.</a> Domest Anim Endocrinol. 37, 45-54 (2009).</li>
<li>Amsterdam, A., May, J. V., Schomberg, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+insulin+and+follicle-stimulating+hormone+on+biochemical+and+morphological+differentiation+of+porcine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of insulin and follicle-stimulating hormone on biochemical and morphological differentiation of porcine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 39 (2), 379-390 (1988).</li>
<li>Monga, R., Sharma, I., Datta, T. K., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+serum-free+buffalo+granulosa+cell+culture+and+analysis+of+genes+involved+in+terminal+differentiation+from+FSH-+to+LH-responsive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Characterization of serum-free buffalo granulosa cell culture and analysis of genes involved in terminal differentiation from FSH- to LH-responsive phenotype.</a> Domest Anim Endocrinol. 41 (4), 195-206 (2011).</li>
<li>Bao, B., Garverick, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+steroidogenic+enzyme+and+gonadotropin+receptor+genes+in+bovine+follicles+during+ovarian+follicular+waves%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: A review.</a> J Anim Sci. 76 (7), 1903-1921 (1998).</li>
<li>Bao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+messenger+ribonucleic+acid+encoding+luteinizing+hormone+receptor%2C+cytochrome+P450+side+chain+cleavage%2C+and+aromatase+are+associated+with+recruitment+and+selection+of+bovine+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Changes in messenger ribonucleic acid encoding luteinizing hormone receptor, cytochrome P450 side chain cleavage, and aromatase are associated with recruitment and selection of bovine ovarian follicles.</a> Biol Reprod. 56 (5), 1158-1168 (1997).</li>
<li>Orisaka, M., Tajima, K., Tsang, B. K., Kotsuji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa-theca+cell+interactions+during+preantral+follicular+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ovarian.+Res%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa-theca cell interactions during preantral follicular development.</a> J. Ovarian. Res. 2 (1), 9(2009).</li>
<li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li>
<li>Kotsuji, F., Kamitani, N., Goto, K., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+theca+and+granulosa+cell+interactions+modulate+their+growth%2C+morphology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bovine theca and granulosa cell interactions modulate their growth, morphology, and function.</a> Biol Reprod. 43 (5), 726-732 (1990).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x Soluzione salina bilanciata di Hank HBSS (w Mg/Ca, rosso fenolo)</td><td>Bio& Vendere</td><td>B. L201-10</td><td>sciogliere in acqua ultrapura; regolare il pH a 7,4 della soluzione di digestione (HBSS e HEPES) ed eseguire la filtrazione sterile prima dell'uso</td></tr><tr><td>Ago 18 G, 40 mm, diametro 1,2 mm</td><td>Roth</td><td>281T.1</td><td>Ago monouso, taglio corto</td></tr><tr><td>Siringa da 3 ml (Omnifix Luer)</td><td>Roth</td><td>LY22.1</td><td></td></tr><tr><td>accutasio</td><td>Merck</td><td>Codice: A6964</td><td>ramo d'azienda: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>amfotericina B (250 &; micro; g/ml)</td><td>Bio& Vendere</td><td>B. AB17.01050</td><td></td></tr><tr><td>androstenedione</td><td>Merck</td><td>46033</td><td>utilizziamo una soluzione madre di 10 mM, diluita in etanolo al 100%; ramo d'azienda: Supelco</td></tr><tr><td>binocolo Carl Zeiss Technival2</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>non applicabile</td><td>utilizzato insieme alla luce incidente Schott KL 1600 LED</td></tr><tr><td>BSA (5%)</td><td>Merck</td><td>A3311</td><td>ramo d'azienda: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>filtro cellulare (100 &micro; m dimensione dei pori)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3945.100</td><td>Montaggio su provette da centrifugazione da 50 ml</td></tr><tr><td>collagene R (0,2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi NB8 (10%)</td><td>Marca del Nord</td><td>S1745601</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per congelamento di celle CoolCell LX&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CLS432002</td><td>prodotto da Corning</td></tr><tr><td>Fiale di crioconservazione (2 ml)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP89020</td><td></td></tr><tr><td>piatto di coltura, 12 pozzetti, fondo piatto</td><td>TPP Faust</td><td>TPP92112</td><td></td></tr><tr><td>piatto di coltura, 24 pozzetti, fondo piatto</td><td>TPP Faust</td><td>TPP92424</td><td></td></tr><tr><td>piatto di coltura, 6 pozzetti, fondo piatto</td><td>TPP Faust</td><td>TPP92006</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS senza Ca2+, Mg2+</td><td>Bio& Vendere</td><td>B. L182-10</td><td>Sciogliere in acqua ultrapura e in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>estradiolo, 17b-[2,4,6,7-3H]</td><td>Hartmann Analytik</td><td>ART1555</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale per vitelli (FBS Superior stabil)</td><td>Bio& Vendere</td><td>FBS. S0615</td><td></td></tr><tr><td>FSH (~7.000 UI/mg; da ipofisi umana)</td><td>Merck</td><td>F4021</td><td>Preferiamo utilizzare una soluzione madre di 2 &micro; g/ml, diluito in NaCl allo 0,9 %; ramo d'azienda: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari sospesi (0,4 & micro; m dimensione dei pori)</td><td>cellQART</td><td>9320412</td><td>Durante l'ordine, essere consapevoli delle diverse proprietà degli inserti; preferiamo una membrana in PET trasparente per la microscopia a contrasto di fase</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Roth</td><td>9105.2</td><td>regolare il pH a 7,4 della soluzione di digestione (HBSS e HEPES) ed eseguire la filtrazione sterile prima dell'uso</td></tr><tr><td>olotransferrina (bovini)</td><td>Merck</td><td>T1283</td><td>sciogliere in acqua sterile; ramo d'azienda: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>innuPREP Kit Mini RNA 2.0</td><td>IST innuscreen</td><td>845-KS-2040250</td><td></td></tr><tr><td>insulina (10 mg/ml; da pancreas bovino)</td><td>Merck</td><td>I0516</td><td>dissolvere in 1x PBS; ramo d'azienda: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Bio& Vendere</td><td>B. K0283</td><td></td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Merck</td><td>I1146</td><td>Utilizziamo una soluzione madre di 200 &micro; g/ml, disciolto in 10 mM di HCl e 1x PBS con 1 mg/ml di BSA; ramo d'azienda: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 1000</td><td>TermoScientifico</td><td>non applicabile</td><td>Misurazione della concentrazione di RNA</td></tr><tr><td>NEA (100x)</td><td>Bio& Vendere</td><td>B. K0293</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina (10.000 UI/10 mg/ml)</td><td>Bio& Vendere</td><td>B. Codice: A2213</td><td></td></tr><tr><td>acqua purificata, adatta per colture cellulari</td><td>Merck</td><td>W3500</td><td>ramo d'azienda: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kit di sintesi di cDNA SensiFAST</td><td>Bioline</td><td>BIO-65054</td><td>fornito tramite il partner di distribuzione BioCat</td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio (7,5%)</td><td>Bio& Vendere</td><td>B. L1713</td><td></td></tr><tr><td>selenito di sodio</td><td>Merck</td><td>S9133</td><td>sciogliere in acqua sterile; ramo d'azienda: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>agitatore termico TS-100C</td><td>Fischer Scientific</td><td>12357627</td><td>utilizzato insieme al blocco HC18 (n. cat. 12337627)</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Bio& Vendere</td><td>B. F0915</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema di co-coltura modificato per la comprensione delle interazioni tra granulosa e cellule dell'arca nell'ovaio bovino

A Modified Co-Culture System for Understanding Granulosa-Theca Cell Interactions in the Bovine Ovary

Sebbene TC e GC siano stati isolati utilizzando tecniche di separazione meccanica consolidate basate sulla compartimentazione follicolare, l'espressione di geni specifici per tipo di cellula CYP17A1 e CYP19A1 è stata valutata per eliminare il rischio di contaminazione incrociata. CYP17A1 era espresso esclusivamente nei TC appena isolati, mentre CYP19A1 era espresso prevalentemente nei GC appena isolati (Figura 2).
Il sistema di co-coltura consente la compartimentazione di cellule di teca bovina e granulosa sui lati opposti di un inserto di membrana, imitando così l'organizzazione spaziale in vivo. Dopo tre giorni di coltura, i TC hanno mostrato una morfologia appiattita e allungata mentre si diffondevano sulla superficie della membrana dell'inserto rivestita di collagene, indicando un attacco riuscito (Figura 3A). Quando sono stati coltivati da soli per l'intero periodo di 9 giorni, i TC hanno continuato a proliferare e hanno raggiunto la confluenza entro il giorno 9 (Figura 3B). Al contrario, i GC coltivati da soli per 6 giorni sulla membrana dell'inserto rivestita di collagene hanno sviluppato un fenotipo simile ai fibroblasti, che è caratteristico dei GC in vitro (Figura 3C). Inoltre, come descritto in precedenza, i GC tendevano a formare cluster, una caratteristica tipica di queste cellule in coltura 5,7,31,32. Nel sistema di co-coltura, non sono state osservate differenze morfologiche apparenti né nei TC né nei GC rispetto alle rispettive monocolture abbinate nel tempo (Figura 3D), indicando che l'ambiente basato sull'inserto mantiene un normale comportamento cellulare. Tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, la valutazione microscopica della co-coltura rimane impegnativa, in particolare per distinguere e valutare la morfologia delle TC indipendentemente dalle altre cellule. Per superare queste limitazioni, è attualmente in fase di studio un protocollo ottimizzato per la fissazione cellulare in conformità con l'esplorazione di strategie alternative per l'identificazione cellulare in assenza di anticorpi specifici per l'immunocolorazione.
La funzionalità del sistema di co-coltura è stata valutata analizzando la produzione ormonale e l'espressione di geni marcatori chiave per TC e GC 33,34, confermando i ruoli steroidogenici specifici del tipo cellulare. Un confronto tra la monocoltura GC e il modello di cocoltura ha rivelato livelli simili di estradiolo (E2) prodotti in vitro. Tuttavia, come previsto, la monocoltura di TC ha prodotto solo quantità trascurabili di E2, in linea con l'ipotesi delle 2-cellule-2-gonadotropina (Figura 4A)15, che afferma che le cellule teca non hanno la capacità di sintetizzare E2 in modo indipendente.
Per valutare ulteriormente la rilevanza fisiologica delle condizioni di coltura, è stata esaminata l'espressione dei geni marcatori chiave33 . In accordo con l'ipotesi della 2-cellula-2-gonadotropina, CYP19A1 era prevalentemente espresso nei GC, mentre CYP17A1 era principalmente rilevato nei TC, un modello osservato sia in condizioni di mono- che di co-coltura (Figura 4B, C). In particolare, l'abbondanza del trascritto di CYP19A1 era più alta nei GC all'interno del sistema di co-coltura rispetto alla mono-coltura GC, nonostante non fossero state osservate differenze nelle concentrazioni di estradiolo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig1.jpg"> 
Figura 1: Rappresentazione schematica dell'allestimento della coltura cellulare. (A) Un diagramma che illustra la camera di inoculazione costruita su misura, che utilizza un tubo troncato sull'inserto invertito per evitare perdite di terreno durante il periodo iniziale di coltura. (B) Cronologia della procedura sperimentale: i TC sono stati coltivati sull'inserto invertito per tre giorni per consentire l'attacco. L'inserto è stato capovolto e i GC sono stati seminati sul lato opposto, seguiti da altri sei giorni di coltura. Lo studio ha confrontato TC e GC coltivati separatamente con il sistema di co-coltura TC-GC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig2.jpg"> 
Figura 2: Espressione genica di marcatori specifici per tipo di cellula in cellule di granulosa e teca appena isolate. (A) CYP17A1 è stato espresso esclusivamente nei TC, mentre (B) CYP19A1 è stato rilevato prevalentemente nei GC, confermando la specificità e la purezza iniziale delle popolazioni cellulari isolate prima della coltura. I dati sono presentati come espressione relativa normalizzata alla media geometrica dei geni di riferimento RPLP0 e TBP. Sono mostrate le medie e l'errore standard delle medie, i dati sono stati testati per la normalità e la varianza, gli asterischi indicano differenze significative (n=3, t-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig3.jpg"> 
Figura 3: Morfologia delle cellule di teca e granulosa in coltura. (A) I TC coltivati per 3 giorni sono stati attaccati alla membrana dell'inserto rivestita di collagene. (B) I TC sono cresciuti fino alla confluenza dopo l'intero periodo di 9 giorni nella monocoltura. (C) I GC mostrano il tipico fenotipo simile ai fibroblasti dopo 6 giorni di coltura. (D) La co-coltura di TC e GC non mostra alcuna differenza morfologica apparente rispetto alle rispettive monocolture abbinate nel tempo. Questa immagine è stata scattata dopo 6 giorni di coltura GC e 9 giorni di coltura TC (al termine dell'esperimento di co-coltura). Barre di scala 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig4.jpg"> 
Figura 4: Analisi dei marcatori funzionali nel sistema di co-coltura. (A) Le concentrazioni ormonali di estradiolo (E2) confermano la funzionalità fisiologica del sistema di coltura cellulare. (B, C) L'analisi dell'espressione genica del marcatore TC CYP17A1 e del marcatore GC CYP19A1 dimostra l'identità e lo stato funzionale di entrambe le popolazioni cellulari. Per calcolare l'espressione relativa è stata utilizzata la media geometrica dei geni di riferimento RPLP0 e TBP . Sono mostrate le medie e l'errore standard delle medie, i dati sono stati testati per la normalità e la varianza, gli asterischi indicano differenze significative (n=3, ANOVA a una via). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Un sistema di co-coltura modificato per la comprensione delle interazioni tra granulosa e cellule dell'arca nell'ovaio bovino

A reliable co-culture of granulosa (GCs) and theca cells (TCs) has the potential to facilitate a more comprehensive understanding of the interactions, ...

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