Microscopia a espansione: Imaging fluorescente ad alta risoluzione con microscopio convenzionale

Siamo biologi cellulari che indagano il ruolo del microtubulo e la loro funzione associata in diversi organismi modello. Miriamo a indagare il loro ruolo nell'organizzazione cellulare, nella morfogenesi, nella ciliogenesi e nella divisione. Negli ultimi cinque anni, abbiamo contribuito alla comprensione della composizione molecolare circolare, in particolare attraverso l'uso della microscopia a espansione.

E così riveliamo la caratteristica chiave del loro assemblaggio e della loro funzione. Combinando la microscopia a espansione con la criofissazione, il nostro protocollo consente immagini ad alta risoluzione preservando la struttura quasi nativa dell'elemento cellulare, superando la principale limitazione della microscopia a super-risoluzione. Quindi la microscopia di espansione è una tecnica a basso costo e facile da implementare che dà accesso a tutto il laboratorio a una risoluzione super.

Per cominciare, usa una siringa e un ago per riempire ogni tubo da cinque millilitri con un millilitro di acetone secco in più sotto un cappuccio chimico. Metti i tubi in posizione verticale in una griglia metallica e mettili nell'azoto liquido per congelarli. Riempi metà di una scatola in polistirene spessa 30 per 30 centimetri con gelo secco, poi riempi il dewar tipo Vitrobot con azoto liquido finché l'evaporazione non si ferma.

Ora, rimuovi il ragno dall'apparato di immersione e riempi la camera metallica di immersione con etano liquido. Aspettare 10 minuti per permettere all'etano di raggiungere l'equilibrio. Poi, prendi una copertura da 12 millimetri con una pinzetta sottile e tamponala su una carta velina per assorbire l'eccesso di mezzo dalla copertina.

Tieni la copertura a metà, usando una pinzetta dotata di un anello di serratura compatibile con il cryo-plunger. Metti la pinzetta che tiene il sottocoperto nel portasturalavandini criogenico e usa carta Whatman per rimuovere via il materiale residuo. Attiva il crio-sturalavandini per immergere il coperchio nella soluzione di etano contenuta nella camera metallica.

Poi, trasferisci rapidamente il copertino nel tubo contenente acetone congelato. Incubare i tubi contenenti le coperture in ghiaccio secco con un angolo di circa 45 gradi. Posizionare il contenitore chiuso su uno shaker orbitale impostato tra 50 e 100 giri al minuto e agitare durante la notte a quattro gradi Celsius per far salire gradualmente la temperatura.

Poi, rimuovi la maggior parte del ghiaccio secco dalla scatola. Continuare l'agitazione sull'oscillatore orbitale per altri 45 minuti per far salire la temperatura da meno 80 gradi Celsius a meno 20 gradi Celsius. Apri e chiudi brevemente ogni tubo per liberare la pressione interna.

Successivamente, trasferire ogni copertura in una piastra a 12 pozzi o in un contenitore adatto pre-riempito con soluzione di etanolo pre-raffreddata al 100%. Dopo un'incubazione di cinque minuti, reidratare le coperture attraverso una serie di etanolo gradato. Dopo aver trasferito le copertine in PBS, mettile al microscopio.

Usa pinzette fini per grattare delicatamente la superficie e orientare tutte le copertine con il lato giusto rivolto verso l'alto. Inserire i copertini in una piastra a quattro pozzi riempita con soluzione da 0,5 a un millilitro di 2%acrilammide e 1,4% di formaldeide in PBS. Poi incubare le coperture in questa soluzione a 37 gradi Celsius senza agitazione.

Poi, scongela il 10% di APS e la soluzione gelificante sul ghiaccio per 10 minuti prima della gelificazione. Prepara una camera umida usando uno strato sottile di tessuto umido e Parafilm. Poi conservalo a quattro gradi Celsius.

Dopo 10 minuti, posiziona la camera umida su un blocco freddo per usarla durante la gelificazione. Ora, rimuovi le coperture dalla soluzione di ancoraggio proteico e tampona il liquido in eccesso usando carta velina in due passate successive. Aggiungi APS alla soluzione gelificante per raggiungere una concentrazione finale dello 0,5% e vortice per due o tre secondi.

Poi, pipetta due gocce da 35 microlitri sul Parafilm nella camera umida e posiziona delicatamente ogni copertura su una goccia, con le cellule rivolte verso il basso nella soluzione gelificante. Trasferire la camera umida in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Per la denaturazione, utilizzare uno strumento per perforazione biopsica con un diametro di 0,4 centimetri per estrarre i pezzi di gel e posizionarli in una piastra a sei pozzi riempita con un millilitro di tampone di denaturazione.

Agitare la piastra per 10-15 minuti, finché i gel non si staccano dalle coperture, e trasferire i pezzi di gel staccati in tubetti microcentrifughe da 1,5 millilitri riempiti con nuovo tampone di denaturazione. Incubare i gel per 90 minuti a 95 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, trasferire i gel in acqua doppia distillata per 10 minuti per il lavaggio.

Misura il diametro dei gel usando carta millimetrica per valutare il fattore di espansione del gel. Ricoprire le coperture pulite con circa 200 microlitri di soluzione di polilisina. Incubare le coperture per un'ora a temperatura ambiente, poi lavarle tre volte con acqua doppia distillata per rimuovere l'eccesso di polilisina.

Dopo che le coperture sono asciutte, conservale a quattro gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Posiziona il gel correttamente orientato, con le cellule rivolte verso l'alto, su carta senza pelucchi e lascia asciugare per eliminare l'eccesso di acqua. Infine, montare i gel essiccati con le cellule rivolte verso il basso su coperture rivestite di poli-D-Lisina.

La criofissazione ha preservato la rete mitocondriale nelle cellule RPE1 in modo più efficace rispetto alla fissazione con PFA, come dimostrato dalla colorazione estere NHS e ATP5A, e ha permesso la risoluzione delle criste mitocondriali, che non erano visibili con la fissazione del PFA. La criofissazione ha portato a una migliore conservazione dei microtubuli dinamici, inclusi i microtubuli citoplasmatici e astrali nelle cellule RPE1 mitotiche, rispetto alla fissazione della PFA. La criofissazione di Trypanosoma brucei ha preservato meglio l'architettura del mitocondrio e la struttura cellulare generale rispetto alla fissazione della PFA, come visualizzato con TDH e colorazione esterica NHS.

Inoltre, la criofissazione ha preservato il reticolo endoplasmatico meglio della fissazione con PFA basata sulla colorazione BIP. Furono osservate crepe nelle cellule RPE1 criofissate, ma queste non disturbavano l'ultrastruttura degli organelli, come i mitocondri o i microtubuli. Una scarsa criofissazione era indicata da strutture simili a bolle e microtubuli ondulati, accompagnati da perdita dell'integrità degli organi membranosi.

La qualità dell'espansione dipendeva dalla nitidezza delle soluzioni di acrilato di sodio, con le soluzioni utilizzabili che apparivano incolori o leggermente gialle e traslucide, mentre quelle inutilizzabili apparivano torbide e arancioni.