Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Benvenuti nel laboratorio del Dott. Hiku Alge Blink. Desideriamo ringraziare l'Istituto della California per la Medicina Rigenerativa per il finanziamento di questo progetto. L'etichettatura delle cellule staminali con un agente di contrasto fluorescente consente il tracciamento in vivo delle cellule staminali trapiantate in vivo.

L'imaging ottico successivo delle cellule staminali marcate consente studi longitudinali in cui è possibile monitorare in modo non invasivo la migrazione delle cellule in vivo. Questo video mostrerà come marcare sia le cellule staminali embrionali umane che le cellule staminali mesenchimali umane con coloranti fluorescenti. Ciao, sono Sophie Boddington del Contrast Agent Research Group del Dipartimento di Radiologia dell'Università della California di San Francisco.

Oggi vorrei mostrarvi due tecniche diverse per etichettare le cellule staminali con agenti di contrasto fluorescenti. Una per etichettare le cellule staminali mesenchimali con il colorante fluorescente DID, e un'altra per etichettare le cellule staminali embrionali umane con endign ingra. Cominciamo dunque mostrandovi la nostra tecnica per etichettare le cellule staminali mesenchimali umane con DID.

Per iniziare la procedura di marcatura delle cellule staminali mesenchimali, dobbiamo trypsinizzare e contare le cellule per ottenere una sospensione con un numero definito di cellule. Poiché si tratta di una tecnica standard di coltura cellulare, non la illustreremo in dettaglio. Dobbiamo sospendere le cellule che intendiamo marcare a una densità di 1 milione di cellule per millilitro in un mezzo di coltura privo di siero.

Prima, aggiungiamo cinque microlitri di agente di contrasto DID per millilitro di sospensione cellulare. Ora mescoliamo la soluzione mediante pipettaggio delicato; le cellule vengono incubate con la soluzione di marcatura in una piastra a sei pozzetti con superficie non aderente a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione semplice, dobbiamo trasferire la soluzione cellulare in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.

Centrifughiamo a 400 RCF per cinque minuti. Successivamente, aspiriamo il mezzo di marcatura avendo cura di non disturbare il pellet. A questo punto laviamo le cellule con PBS.

Pipettiamo le cellule su e giù, assicurandoci di disperdere il pellet cellulare. Ripetiamo questi ultimi due passaggi altre due volte, per un totale di tre cicli di lavaggio.

Ora contiamo le cellule ed eseguiamo un test triplo e blu per determinare la vitalità cellulare. Dopo aver determinato la vitalità cellulare, le cellule sono pronte per essere analizzate nell'imager ottico. Per iniziare la procedura di marcatura delle cellule staminali embrionali umane, dobbiamo prima preparare l'agente di contrasto noto come verde indocianina.

Successivamente, lo mescoliamo con l'agente di trasfezione noto come protamina. Per iniziare, pesiamo un milligrammo di polvere di verde indocianina e la disciolgiamo in cento microlitri di DMSO. Aggiungiamo 400 microlitri di DMEM contenente 10% di FCS alla miscela e agitiamo bene, ottenendo una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro di verde indocianina.

Successivamente, aggiungiamo l'agente di trasfezione protamina, che funge da veicolo per l'agente di contrasto, consentendogli di entrare nella cellula in modo più efficiente. Ora mescoliamo cinque microlitri di solfato di protamina al 10 milligrammi per millilitro con 300 microlitri di ICG e 300 microlitri di DMEM privo di siero. A questo punto agitiamo la nuova soluzione di trasfezione per cinque minuti per permettere la formazione dei complessi.

Successivamente, aspiriamo il vecchio mezzo e aggiungiamo 10 millilitri di DMEM PRE-RISCALDATO alle cellule. Aggiungiamo la soluzione di protamina ICG precedentemente preparata alle cellule e iniziamo l'incubazione di un'ora posizionando la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, rimuoviamo la piastra dall'incubatore, aspiriamo la soluzione di marcatura e laviamo le cellule risciacquando la piastra con cinque millilitri di PBS.

Le cellule vengono quindi trattate con tripsina per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Agitare la piastra aiuta a staccare le cellule e sospenderle. Ora pipettiamo delicatamente su e giù per disperdere le colonie rimanenti.

Neutralizziamo la tripsina aggiungendo un volume uguale di DMEM contenente FCS al 10% alla piastra. Successivamente, trasferiamo la soluzione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifughiamo la sospensione a 400 RCF per cinque minuti. Risospendiamo le cellule in mezzo completo.

Ora possiamo eliminare gli aggregati residui o i complessi passando le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Una volta ottenuta una sospensione cellulare priva di aggregati, aspiriamo il vecchio mezzo e risospendiamo il pellet nel mezzo completo per cellule staminali embrionali umane preriscaldato. A questo punto, dobbiamo separare le cellule di supporto murine dalle cellule staminali embrionali umane.

Questo passaggio garantisce che in seguito si stiano visualizzando esclusivamente le cellule staminali. A tale scopo, si trasferisce la soluzione cellulare in una piastra di Petri da 10 centimetri rivestita con gelatina. La piastra viene quindi posta nell'incubatore a 37 °C e lasciata riposare per 45 minuti.

Durante questo periodo, assicurarsi di non disturbare la piastra. A questo punto, le cellule nutrici aderiranno alla piastra mentre le cellule staminali no. Trasferiamo la soluzione fuori dalla piastra di Petri e ora abbiamo una soluzione etichettata di cellule singole di cellule staminali embrionali umane.

Ora possiamo contare le cellule ed eseguire un test triplo in blu su di esse. Dopo aver confermato la vitalità, le nostre cellule sono pronte per essere analizzate mediante imaging. La diapositiva mostra un esempio di come le cellule staminali possano essere visualizzate in vivo nei topi dopo essere state marcate con un agente di contrasto fluorescente e somministrate mediante iniezione intraperitoneale.

Scansioni ottiche seriali hanno mostrato un iniziale accumulo delle cellule nei polmoni, seguito da una ridistribuzione nel fegato, nel midollo osseo delle estremità e nella ghiandola tiroidea. L'etichetta fluorescente può essere utilizzata anche per la rappresentazione diretta di cellule staminali trapiantate in campioni di istopatologia mediante microscopia fluorescente. Vi abbiamo appena mostrato come etichettare le cellule staminali con agenti di contrasto fluorescenti durante l'etichettatura cellulare.

È importante ricordare di standardizzare ogni passaggio. Lo facciamo per garantire un'efficienza di marcatura e una vitalità cellulare costanti, in modo che i risultati di esperimenti diversi possano essere confrontati. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con la vostra etichettatura cellulare.