Name: Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri come etichettare cellule staminali embrionali e mesenchimali umane con tinture fluorescenti per il tracciamento in vivo mediante imaging ottico. Questa tecnica non invasiva consente studi longitudinali sulla migrazione cellulare.

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Questo progetto è stato sostenuto da una borsa SEED J. Leon Thal del California Institute per la Medicina Rigenerativa. Tobias Henning è stato finanziato da una borsa di studio di ricerca dal tedesco Research Association (DFG, SE 4578/1-2). Vogliamo riconoscere con gratitudine Meneses Juanito per i suoi consigli sulla cultura di cellule staminali embrionali umane.

Etichettatura delle cellule staminali mesenchimali con il colorante fluorescente DiD <ol><li> Per iniziare la procedura per l&#39;etichettatura di cellule staminali mesenchimali, trypsinize e contare le cellule per ottenere una sospensione con un numero definito di cellule. </li><li> Prendete le cellule fuori dell&#39;incubatore ed aspirare i vecchi media dai recipienti contenenti le cellule da etichettare </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di Mg / Ca-free PBS. Aspirare il PBS. La Mg e Ca inibirebbe la tripsina, quindi usiamo PBS senza questi. </li><li> Aggiungi preriscaldata tripsina 0,05%, per un pallone T75 si usa 5ml. Garantire che l&#39;intera superficie del pallone è coperto. </li><li> Incubare a 37 ° C in incubatrice per circa 5 minuti. </li><li> Confermare il distacco sotto il microscopio. Se le cellule ancora aderire al pallone, che tocca un paio di volte e aspettare un po &#39;di più fino a quando il tripsinizzazione va a buon fine. </li><li> Ora, è necessario per neutralizzare l&#39;tripsina con l&#39;aggiunta di supporti contenenti il ​​10% FCS. Noi usiamo una pari quantità di mezzi di comunicazione in quanto vi è tripsina. </li><li> Pipetta su e giù per un paio di volte a garantire che tutte le cellule sono risospese nei media. </li><li> Trasferire la soluzione di cella a un tubo 15ml sterile in polipropilene con cappuccio. </li><li> Centrifugare a 400 rcf per 5 minuti. </li><li> Aspirare il sopranatante assicurando di non disturbare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule in DMEM e procedere con la conta delle cellule. </li><li> Sospendere le cellule a essere etichettato con una densità di 1x10 ^ 6 per ml nel siero senza terreno di coltura (DMEM). </li><li> Questo era tutto preparazione della sospensione cellulare. Ora, è pronto per iniziare l&#39;etichettatura. </li><li> In primo luogo, aggiungere 5 ml di mezzo di contrasto DiD per ml di sospensione cellulare. </li><li> Poi, mescolare la soluzione pipettando gentilmente. </li><li> Incubare le cellule con la soluzione di etichettatura a 37 ° C per 20 minuti in un 6-ben poco attaccamento piatto. </li><li> Una volta che l&#39;incubazione semplice è completa, è necessario trasferire la soluzione di cellule in una provetta da 15 ml con tappo in polipropilene. </li><li> Centrifuga verso il basso a 400 rcf per 5 minuti. </li><li> Aspirare il medium etichettatura, assicurando di non disturbare il pellet. </li><li> Lavare le cellule con PBS. Pipettare le cellule su e giù, facendo attenzione a rompere il pellet. </li><li> Ripetere gli ultimi due passi due volte, quindi c&#39;è un totale di 3 fasi di lavaggio. </li><li> Contare le celle ed eseguire un test Blu tripano per determinare la vitalità cellulare. Questi sono i protocolli standard di coltura cellulare che non stiamo andando a spiegare qui. </li><li> Le vostre cellule sono ora pronti per essere ripreso in imager ottica. </li></ol> Etichettatura delle cellule staminali embrionali umane con il colorante fluorescente ICG <ol><li> Per iniziare la procedura per l&#39;etichettatura di cellule staminali embrionali umane, preparare il mezzo di contrasto verde indocianina. Mescolare con il Protamina agente di trasfezione. </li><li> Misurare 1mg di polvere verde indocianina. Sciogliere la polvere ICG in 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Aggiungere 400 ml di Dulbecco modificato (DMEM + 10% Fetal Calf Serum), media per l&#39;impasto e agitare bene. Ciò si traduce in una concentrazione finale di 2mg/ml del verde indocianina. </li><li> Aggiungere il protamina agente di trasfezione. Atti protamina come un servizio navetta per il mezzo di contrasto, in modo che entra nella cellula in modo più efficiente. </li><li> Mescolare 5 microlitri protamina solfato, che viene fornito ad una concentrazione di 10mg/ml, con 300 microlitri ICG e 300 ml di siero libero Dulbecco Modified Media Eagles. </li><li> Agitare delicatamente la nuova soluzione di trasfezione per 5 minuti per consentire di formare complessi. </li><li> La soluzione di etichettatura è pronto. </li><li> Aspirare i vecchi media da 10 millimetri piatto hESC Petri. </li><li> Aggiungere 5 ml di pre-riscaldato DMEM senza siero. </li><li> Aggiungere la soluzione precedentemente preparata Protamina / ICG alle cellule. Avviare l&#39;incubazione 1 ora di mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere il piatto dal termostato ed aspirare la soluzione di etichettatura. </li><li> Lavare le cellule con il risciacquo il piatto con 5 ml di PBS. </li><li> Aspirare il PBS e sostituirlo con 5 ml di tripsina 0,25%. Incubare il piatto a 37 ° C per 5 minuti per consentire tripsinizzazione a verificarsi. Aiuta a scuotere il piatto un po &#39;ogni tanto un po&#39;. </li><li> Pipettare delicatamente su e giù, per rompere le colonie rimanenti. </li><li> Neutralizzare la tripsina con l&#39;aggiunta di una quantità uguale di KSR al piatto. </li><li> Trasferire la soluzione di cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare la soluzione a 400 rcf per 5 minuti. </li><li> Risospendere le cellule in mezzi di comunicazione completo. </li><li> Se ci sono ancora aggregati a questo punto, trypsinize e centrifugare di nuovo. </li><li> Una volta che un gruppo senza soluzione di cella è raggiunto, aspirare i vecchi media e risospendere il pellet in 10ml di media piena pre-riscaldato ESC. </li><li> A questo punto, è necessario separare le cellule di alimentazione del mouse dal hESC. Questo viene fatto per garantire che, in seguito, solo le immagini delle cellule staminali avviene. </li><li> Per questo, il trasferimento °e soluzione di cella a una gelatina rivestito piatto 10 cm. </li><li> Mettere il piatto nel 37 ° C incubatore e lasciare riposare per 45 minuti. Durante questo tempo, fare attenzione a non disturbare il piatto. Ora, gli alimentatori aderirà al piatto e le cellule staminali non lo faranno. </li><li> Trasferire la soluzione fuori della scatola di Petri. e ora abbiamo una etichetta singola soluzione cellule di cellule staminali embrionali umane. </li><li> Le celle possono essere contati e un test Blu tripano può essere eseguito su di loro. </li><li> Le cellule sono pronte per essere ripreso! </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

OI è una relativamente nuova tecnica di imaging, basato sul rilevamento di fluorescenza. OI è sensibile come radiofarmaco a base di tecniche di imaging, ma non associato ad alcuna esposizione irradiazione. OI fornisce un mezzo efficace di cellule monitoraggio non invasivo e ripetitivo, quindi permettono di approfondire la migrazione delle cellule al sito di destinazione. Una limitazione importante di questa tecnica è la penetrazione nei tessuti limitato di sonde fluorescenti in vivo. Così, un accumulo di tracciante nei tessuti profondi, più...

<table><tbody><tr><td>Indocianina verde (IR-125)</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM ad alto contenuto di glucosio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Diluire alla concentrazione finale dello 0,1% in PBS</td></tr><tr><td>PBS, privo di Mg e Ca</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FCS, caratterizzato</td><td>Reagente</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Setaccio per cellule (40 &amp;mu;m in nylon)</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Reagente</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Sostituto del siero Knockout</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapt&amp;#8211;etanolo</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina 200 mM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di protamina</td><td>Reagente</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

etichettatura cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con optical imaging

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

L&#39;imaging ottico (OI) è uno strumento facile, veloce ed economico per il monitoraggio in vivo di nuove terapie basate sulle cellule staminali. La tecnica si basa sulla etichettatura ex vivo di cellule staminali con un colorante fluorescente, a seguito di iniezione endovenosa di cellule etichettate e la visualizzazione dei loro accumulo in organi bersaglio specifici o patologie. La tecnica è una dimostrazione il modo in cui l&#39;etichetta cellule staminali mesenchimali (hMSC) semplice da incubazione con il colorante fluorescente lipofili DiD (C67H103CIN2O3S) e come etichetta cellule staminali embrionali umane (hESC) con la FDA ha approvato colorante fluorescente verde indocianina (ICG). Il meccanismo di assorbimento è attraverso l&#39;aderenza e la diffusione del colorante lypophilic attraverso il doppio strato di fosfolipidi di membrana delle cellule. L&#39;efficienza di etichettatura di solito è migliorata se le cellule sono incubate con il colorante nel siero privo di mezzi di comunicazione invece di incubazione nel siero contenenti media. Inoltre, l&#39;aggiunta del solfato di protamina trasfezione agente migliora sensibilmente l&#39;assorbimento agente di contrasto.

Questo video mostra le tecniche per l&#39;etichettatura delle cellule staminali embrionali umane e cellule staminali mesenchimali con coloranti fluorescenti. Questa tecnica può essere utilizzata per un monitoraggio in vivo di cellule staminali trapiantate con imaging ottico e per le correlazioni istopatologiche con microscopia a fluorescenza.

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

L'imaging ottico (OI) è uno strumento semplice, rapido ed economico per il monitoraggio in vivo di nuove terapie basate su cellule staminali. La tecnica si basa su ex vivo...

Benvenuti nel laboratorio del Dott. Hiku Alge Blink. Desideriamo ringraziare l'Istituto della California per la Medicina Rigenerativa per il finanziamento di questo progetto. L'etichettatura delle cellule staminali con un agente di contrasto fluorescente consente il tracciamento in vivo delle cellule staminali trapiantate in vivo.L'imaging ottico successivo delle cellule staminali marcate consente studi longitudinali in cui è possibile monitorare in modo non invasivo la migrazione delle cellule in vivo. Questo video mostrerà come marcare sia le cellule staminali embrionali umane che le cellule staminali mesenchimali umane con coloranti fluorescenti. Ciao, sono Sophie Boddington del Contrast Agent Research Group del Dipartimento di Radiologia dell'Università della California di San Francisco.Oggi vorrei mostrarvi due tecniche diverse per etichettare le cellule staminali con agenti di contrasto fluorescenti. Una per etichettare le cellule staminali mesenchimali con il colorante fluorescente DID, e un'altra per etichettare le cellule staminali embrionali umane con endign ingra. Cominciamo dunque mostrandovi la nostra tecnica per etichettare le cellule staminali mesenchimali umane con

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Per la valutazione delle terapie con cellule staminali nuovo, è importante non invasiva traccia le cellule iniettate in vivo. Questo video vi mostrerà come etichetta cellule staminali mesenchimali ed embrionali con il ferro mezzi di contrasto a base di ossidi in vivo per la successiva RM in vivo.

Etichettatura hESC e hMSCs con nanoparticelle di ossido di ferro per i non-invasiva in vivo inseguimento con la RM

Con il crescente interesse per le terapie con cellule staminali, le tecniche di imaging molecolare sono ideali per il monitoraggio del comportamento delle cellule staminali dopo il trapianto. Geni reporter luciferasi hanno permesso non invasiva, la valutazione ripetitivo della sopravvivenza cellulare, la posizione e la proliferazione in vivo. Questo video dimostra come monitorare la proliferazione hESC in un topo vivo.

In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

Abbiamo descritto una tecnica per l'etichettatura e tracciabilità delle cellule staminali con la FDA ha approvato, superparamagnetiche ossido di ferro (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Questa tecnica di imaging cellulare che utilizza la risonanza magnetica (RM) per la visualizzazione, è facilmente accessibile per monitoraggio a lungo termine e la diagnosi di engraftments staminali successo o insuccesso delle cellule nei pazienti.

Etichettatura cellule staminali con Ferumoxytol, un approvati dalla FDA nanoparticelle di ossido di ferro

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In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

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L'incisivo del topo contiene preziose cellule che conservano l'etichetta nella sua nicchia di cellule staminali. Abbiamo un nuovo modo per rilevare e quantificare in modo imparziale le celle che conservano l'etichetta; il nostro studio ha utilizzato l'etichettatura EdU e un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia del tessuto PEGASOS della mandibola.

Rilevamento e quantificazione delle cellule che conservano l'etichetta negli incisivi di topo utilizzando un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia dei tessuti

Scopri come etichettare cellule staminali embrionali e mesenchimali umane con tinture fluorescenti per il tracciamento in vivo mediante imaging ottico. Questa tecnica non invasiva consente studi longitudinali sulla migrazione cellulare.

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