Microscopia di localizzazione ecografica per la mappatura a super-risoluzione della microvascolarizzazione del cervello dei roditori

La nostra ricerca mira a caratterizzare l'architettura microvascolare e il flusso del cervello, affinando al contempo i metodi di ultrasuoni a super-risoluzione. Gli sviluppi recenti hanno ottimizzato il tracciamento delle microbolle e rafforzato le pipeline di elaborazione per creare protocolli più stabili per la mappatura vascolare a super-risoluzione con ULM. Per cominciare, posiziona un mouse anestetizzato su una struttura stereotassica con una borsa riscaldante impostata a 37 gradi Celsius.

Utilizzando una pressione ferma ma non dannosa, pizzica dito o coda per verificare l'assenza di riflessi e confermare la profondità dell'anestesia adeguata. Applica una pomata oculare su entrambi gli occhi per prevenire ulcerazioni e formazione di cataratta durante la procedura. Ora, rasa la testa del topo usando un tagliacapelli.

Applica la crema depilatoria. Lascia riposare per un massimo da uno a 1,5 minuti, poi risciacqua accuratamente con acqua tiepida e asciuga con una garza. Successivamente, applica gel a ultrasuoni centrifugato sulla testa per garantire un accoppiamento acustico.

Per la cateterizzazione delle vene caudali, si utilizza un set di infusione alata da 27 gauge da mezzo pollice collegato a un ago da mezzo pollice da 18 gauge con otto pollici di tubo. Accorcia il tubo, se possibile, per minimizzare il volume morto. Ruota delicatamente la coda dell'animale di 90 gradi per esporre le vene laterali della coda.

Poi fissa la coda in posizione con del nastro adesivo per mantenere la stabilità e prevenire movimenti durante la cateterizzazione. Ora, identifica la vena caudale. Per migliorare la visibilità delle vene, riscalda la coda con acqua tiepida per favorire la vasodilatazione.

Con un dito, applica una pressione delicata alla base della coda e scorri verso il sito di iniezione contro la direzione del flusso sanguigno. Inserisci l'ago parallelo alla vena con la smussa rivolta verso l'alto. Osserva il tubo per eventuali flashback del sangue per confermare la corretta posizione dell'ago.

Sul sistema di imaging, avvia il software funzionale per l'acquisizione dell'ecografia e crea una nuova sessione di esperimento. Regola la posizione della sonda ecografica. Ora, avvia l'acquisizione della visualizzazione in tempo reale nel software e regola la sonda in tempo reale usando Power Doppler per centrare il cervello sullo schermo.

Ottimizza i parametri di immagini, come contrasto e compressione, per migliorare la qualità della visualizzazione. Poi, apri il menu Angio 3D nel software di acquisizione. Regola i parametri di scansione per coprire completamente il cervello, poi inizia l'acquisizione della scansione.

Mantieni aperto il software di acquisizione e, una volta terminato l'Angio 3D, avvia il software IcoStudio per analisi e visualizzazione. Carica la scansione 3D di Angio per la revisione. Naviga fino al pannello di registrazione cerebrale e registra la scansione 3D Angio usando la modalità completamente automatica o manuale.

Salva la registrazione completata come file BPS. Ora, apri il menu di navigazione Cervello e scorri fino al pannello del gestore Atlas. Usa il navigatore di alberi genitori e figli per sfogliare l'atlante cerebrale di Allen Mouse e seleziona le regioni anatomiche desiderate per la sovrapposizione nel pannello a tre viste.

Scegli un piano di imaging che si sovrappone alle regioni di interesse selezionate. Nella visuale coronale, posiziona manualmente due marcatori per definire la sezione di imaging desiderata. Poi, clicca su BPS Positioning per estrarre le coordinate motorie del piano di imaging selezionato.

Rivedi l'anteprima dell'immagine dalla scansione 3D Angio e clicca su Copia coordinate BPS. Passa al software IcoScan e apri il pannello Move probe. Clicca su Neuronavigazione, incolla i valori copiati e permette al sistema di allineare automaticamente la sonda con il piano di imaging selezionato.

Poi, avvia l'imaging in tempo reale per confermare che il piano di imaging attuale sia allineato con il piano precedentemente selezionato. Utilizzando una siringa sterile, inietta cinque millilitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% nella fiala microbolla dell'agente di contrasto a ultrasuoni attraverso il setetto. Agitare vigorosamente la fiala per 20 secondi per sospendere le microbolle e garantire una dispersione uniforme.

Predefinire i parametri di registrazione, inclusa sequenza ecografia, frame rate e durata totale della registrazione. Poi, preleva il volume desiderato di microbolle per l'iniezione e inizia l'acquisizione. Una volta iniziata l'acquisizione, iniettare 100 microlitri per i topi utilizzando la diluizione appropriata.

Conferma l'aumento del contrasto sul pannello di visualizzazione in tempo reale. Lava immediatamente le microbolle rimanenti nel volume morto iniettando liquido fisiologico nel catetere. Aspetta che l'acquisizione si concluda e salvi i dati registrati.

Apri il software Icolab e clicca sulla scheda Microscopia di localizzazione dell'ecografia. Poi, clicca su Calcola le mappe ULM per iniziare il flusso di lavoro di elaborazione. Seleziona la cartella sorgente che contiene i dati acquisiti in precedenza.

Successivamente, seleziona il file di scansione specifico da elaborare e regola i limiti dei tempi di elaborazione secondo necessità. Clicca su Avanti per passare al passaggio di segnalazione. Imposta il percorso della cartella di output per salvare i file elaborati e configura i parametri di visualizzazione per le immagini del report.

Ora clicca su Esegui per iniziare a elaborare i dati. Una volta completato, verrà creato un file TRK contenente coordinate localizzate della microbolla, insieme a file TIFF che rappresentano densità, velocità e ampiezza retrodiffusa. Carica il file TRK in IcoStudio per iniziare a esplorare i dati elaborati.

Poi, usa il pannello laterale destro di IcoStudio per regolare parametri di visualizzazione come contrasto, compressione e mappa dei colori per migliorare la rappresentazione dei dati. Per impostare il tempo di integrazione, si regola il doppio cursore situato in basso nella vista principale per definire i fotogrammi di inizio e fine dell'analisi. La scheda densità mostra la distribuzione delle occorrenze di microbolle.

Scegli tra densità assoluta e densità direzionale. Dopodiché, clicca sulla scheda Velocità per visualizzare la velocità della microbolla in millimetri al secondo usando modalità assoluta, direzionale, assiale e laterale. Regola le soglie di contrasto, compressione e velocità per migliorare la nitidezza dell'immagine.

Poi esplora la scheda Ampiezza Retrodiffusa per vedere la riflettività delle microbolle, che aumenta il contrasto e rivela strutture microvascolari e il movimento fuori piano. Esporta immagini come PNG ad alta risoluzione, oppure genera file TIFF per analisi quantitative con dimensioni di pixel personalizzabili. Le mappe di densità di microbolle di una fetta cerebrale coronale di ratto acquisita con ULM hanno risolto sia grandi vasi sia strutture capillari fini, rivelando una topologia vascolare dettagliata, inclusi biforcazioni e schemi di ramificazione.

La mappa delle velocità dello stesso taglio cerebrale mostrava un flusso assiale direzionale chiaro, con il flusso verso l'alto che rappresenta il drenaggio venoso e il flusso discendente corrispondente alla perfusione arteriosa, coerente con l'architettura vascolare corticalo nota. La mappa di ampiezza retrodiffusa forniva contrasto dipendente dalla profondità e evidenziava i recipienti in base alla loro posizione elevazionale, utile per segmentare recipienti fuori piano o a bassa ampiezza. Le mappe di densità vascolare acquisite con una distanza debole nello stesso topo hanno mostrato una forte sovrapposizione spaziale, confermando la riproducibilità del targeting sul piano coronale utilizzando il sistema di posizionamento cerebrale.

L'analisi quantitativa della corteccia somatosensoriale sinistra tra le sedute ha mostrato distribuzioni simili nel raggio del vaso, nella velocità e nella portata del vaso, dimostrando la riproducibilità delle misurazioni. Una riproducibilità simile è stata osservata nella regione del talamo sinistro, con valori coerenti per il raggio del vaso, la velocità e la portata tra la prima e la seconda settimana di sessione. Questo lavoro stabilisce che la microscopia di localizzazione a ultrasuoni può produrre in modo affidabile mappe a super-risoluzione della struttura e del flusso microvascolare in vivo.

Questo protocollo soddisfa la necessità di una procedura standardizzata che consenta acquisizioni robuste di ULM nei roditori viventi utilizzando un sistema ecografia funzionale dedicato.