Modello di resezione tumorale rilevante per traduzione per modelli preclinici di murina di carcinoma squamoso orale

Questo lavoro si concentra sullo studio dei tumori orali, stabilendo un modello preclinico pratico per la resezione e la recidiva tumorale ortotopica. La chirurgia è una modalità di trattamento primaria per la maggior parte dei pazienti con cancro orale. Questo protocollo ci permette di indagare su questo.

Per cominciare, procurarsi una fiaschetta di coltura contenente cellule tumorali orali di Mach Due all'80% confluenti. Rimuovi il materiale di coltura dalla fiaschetta. Lava le cellule attaccate con PBS senza magnesio e calcio per rimuovere il siero residuo.

Aggiungi un volume sufficiente per coprire completamente la superficie del recipiente contenente le celle, poi aspira. Aggiungere lo 0,05% di tripsina nella fiaschetta di coltura per coprire sufficientemente la superficie inferiore. Incubare la fiaschetta a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per circa 5 minuti per permettere il distacco cellulare.

Quando si osserva distacco cellulare, si stinge la tripsina aggiungendo almeno il doppio del volume del mezzo completo. Mescola delicatamente per fermare l'attività enzimatica. Trasferisci la sospensione della cella su un tubo centrifuga e centrifuga a 350G per 5 minuti a temperatura ambiente.

Scartare il soprantantante dopo la centrifugazione. Sospezione nuovamente la pellet cellulare in PBS freddo. Rimuovi un'aliquota della sospensione per il conteggio delle celle.

Utilizzando PBS aggiuntivo, regolare la sospensione cellulare alla concentrazione ottimizzata per l'inoculazione. Tieni la sospensione della cella preparata sul ghiaccio fino a quando non è pronta all'uso. Mescola accuratamente la sospensione delle celle per garantire una distribuzione uniforme.

Raccogli la sospensione in una siringa di insulina da 0,3 millilitri. Tenere il topo anestetizzato con una mano dalla parte posteriore del collo, così il lato anteriore è rivolto verso il conduttore e la testa è inclinata verso l'alto. Mantieni la bocca in una posizione aperta e accessibile.

Inserire con attenzione la siringa nella bocca aperta con un angolo verso il basso verso il vestibolo mandibolare inferiore sinistro. Fai avanzare l'ago attraverso la mucosa buccale inferiore. Somministrare 30 microlitri della sospensione della cella nella regione bersaglio.

Tieni ferma la siringa per 5 secondi, poi ritirala lentamente per evitare che le cellule si traccinano. Assicurarsi che il topo torni alle condizioni fisiche e comportamentali normali dopo l'inoculazione. Man mano che i tumori si sviluppano, monitorare il peso del topo anestetizzato usando un bilanciamento e valutare la crescita tumorale con un calibro digitale due volte a settimana.

Scegli una sala procedura pulita, con una porta chiudibile e traffico limitato. Metti una nuova gabbia con biancheria pulita e asciutta e un nido di carta assorbente, in parte su un riscaldatore elettrico per preriscaldarla. Riscalda uno sterilizzatore a perline a una temperatura operativa di 250-265 gradi Celsius.

Accendi un assorbimento chirurgico riscaldato ad acqua e impostalo a circa 39 gradi Celsius. Applica una piccola quantità di crema depilatoria sul sito della resezione tumorale su un topo anestetizzato utilizzando un applicatore con punta di cotone. Assicurati di avere margini sufficienti per tenere i peli fuori dall'area dell'incisione.

Dopo 10 secondi, asciuga i capelli usando una garza asciutta e pulita. Rimuovere eventuali residui di crema con garze o cotton fioc inumidi con acqua. Posiziona il topo anestetizzato sulla borsa termica in posizione supina con il lato anteriore rivolto verso l'alto.

Posiziona il naso appena dentro il cono nasale. Ora applica una quantità sufficiente di unguento lubrificante sterile su ciascun occhio per evitare la secchezza durante la procedura. Utilizzando un applicatore pulito con punta di cotone, preleva il tampone sul sito della resezione con alcol isopropilico al 70% seguito da iodio al 10%, e ripeti la sequenza tre volte.

Rimuovere lo iodio dopo l'ultima passata con alcol isopropilico al 70%. Indossando guanti sterili e attrezzature di protezione individuale appropriate, preparare un campo sterile di almeno 18 pollici di larghezza per 26 pollici di lunghezza. Disposizionete tutti gli strumenti e materiali sterili necessari.

Copri il topo con una copertura sterile. Usando forbici sterili, taglia un foro di accesso sopra il sito della resezione. Con un nuovo bisturi chirurgico, crea un'incisione submandibolare appena sotto il tumore lungo la linea della mascella sinistra.

Utilizzando l'emostati di Hartmann, allargare delicatamente l'apertura dell'incisione verso il tumore. Tampona il sangue con garze sterili se necessario. Individua il tumore e tienilo in posizione usando le pinze.

Un assistente in DPI sterili può tenere fermo il topo o la sua pelle durante questa procedura. Usando forbici chirurgiche, taglia intorno alla base del tumore per sezionare tutto il tessuto visibile. Riposiziona la pelle sopra il sito tumorale resezionato, poi chiudi l'incisione con 4-6 suture interrotte usando suture Vicryl 4/0 a lunga durata.

Dopo aver chiuso l'incisione, trasferire delicatamente il topo nella gabbia preriscaldata e monitorarla per il ritorno della coscienza e della mobilità fino al completo recupero. Fornisci immediatamente cibo ammorbidito mettendo pellet insaponati in acqua in un contenitore accessibile all'interno della gabbia. Se non si verificano complicazioni, riprendi la dieta normale e solida del topo alla poppata di routine successiva.

Utilizzando la linea cellulare Mach Two, i tumori sono stati stabiliti e resezionati dalla mucosa buccale murina della cavità orale. La cinetica della crescita tumorale è stata caratterizzata prima della resezione. Dopo la resezione tumorale, è stato osservato un ritardo nella crescita tumorale nei giorni immediatamente successivi all'intervento, come dimostrato dalla riduzione dell'area tumorale poco dopo la resezione rispetto ai tumori non resezionati.

Una lieve estensione della sopravvivenza complessiva è stata osservata nel gruppo resezionato rispetto al gruppo di controllo non resezionato, anche se questa differenza non era statisticamente significativa. I topi del gruppo non resezionato hanno raggiunto per la prima volta i criteri di eutanasia al 12° giorno post-intervento, mentre quelli del gruppo resezionato non hanno soddisfatto i criteri fino al giorno 19. La considerazione più importante nell'utilizzo di questo protocollo è la coerenza nell'inoculazione e nell'ingrazione tumorale.

Oltre a questa procedura, possiamo processare i tumori resezionati per l'analisi tramite citometria di flusso o immunoistochimica. Studi futuri potranno sviluppare questo lavoro combinandosi con ulteriori trattamenti. Puoi anche approfondire l'indagine del microambiente immunitario tumorale in relazione alla resezione e alla recidiva.