Clearing ottico transitorio utilizzando molecole assorbenti per l'imaging ex vivo e in vivo

Questa ricerca mira a valutare e implementare il clearing tissutale utilizzando molecole assorbenti come strategia non invasiva per migliorare l'imaging biomedico sia nei tessuti ex vivo che negli animali vivi. Abbiamo dimostrato che il colorante alimentare tartrazina può essere utilizzato per ottenere una pulizia ottica rapida e reversibile sia nei tessuti che negli animali vivi, migliorando significativamente la profondità e la chiarezza dell'imaging. Il nostro protocollo affronta una lacuna critica nella riproducibilità della pulizia ottica transitoria osservando le molecole e incorpora tecniche avanzate di visualizzazione computazionale per migliorare la visibilità delle caratteristiche.

Fornendo un protocollo dettagliato per la pulizia dei tessuti con molecole assorbenti, il nostro lavoro aiuta la più ampia comunità di ricerca in biologia e imaging biomedico ad applicare questi metodi nei propri studi. Il nostro laboratorio ha fatto progredire questa tecnologia esplorando l'interazione fisica tra luce e tessuto, ampliando la gamma di materiali disponibili e sviluppando piattaforme di imaging ottico ottimizzate. Per iniziare, calcolare la massa richiesta di polvere di colorante tartrazina per preparare il volume di soluzione desiderato.

Trasferire la quantità calcolata di polvere colorante in una fiala di vetro pulita. Utilizzando una pipetta volumetrica, aggiungere il volume richiesto di acqua deionizzata alla fiala per mantenere la precisione. Se il colorante non si dissolve completamente a temperatura ambiente, mettere la fiala di vetro in un forno da laboratorio preriscaldato a 40 gradi Celsius per 10 minuti o fino a completa dissoluzione.

Quindi agitare la soluzione colorante per 30 secondi a un minuto per garantire la completa dissoluzione. Per il tessuto ex vivo, affettare un tessuto di petto di pollo allo spessore desiderato in una direzione parallela alle fibre di collagene e pulire delicatamente il tessuto affettato con acqua. Posizionare il tessuto tra due vetrini da microscopio puliti per misurare lo spessore.

Premere delicatamente i vetrini insieme e utilizzare un calibro a nonio per misurare la distanza al centro del tessuto. Quindi, immergere il tessuto nella soluzione colorante preparata. Posizionare il contenitore su un agitatore orbitale e agitare a 100 giri al minuto per 10 minuti.

Rimuovere il fazzoletto dalla soluzione colorante utilizzando una pinza pulita. Posizionare il campione tra due vetrini trasparenti e acquisire le immagini utilizzando una fotocamera digitale o scientifica impostata sulla risoluzione e l'ingrandimento appropriati. Condurre il processo di imaging in un ambiente a luce controllata per ridurre al minimo l'interferenza della luce esterna.

Per misurare la trasmissione ottica, posizionare il campione preparato in uno spettrometro UV-visibile nel vicino infrarosso. Assicurarsi che il sistema sia correttamente basato sulla base e che il raggio di luce passi attraverso la stessa regione del tessuto prima e dopo il trattamento con la soluzione colorante per mantenere la coerenza della misurazione. Per la procedura, posizionare l'animale anestetizzato su un termoforo temperato a 37 gradi Celsius.

Utilizzando un tosaerba per animali di piccola taglia, tagliare il pelo dall'area di imaging desiderata. Applicare la crema depilatoria sulla zona tagliata per meno di 60 secondi per rimuovere eventuali peli residui e rimuovere immediatamente la crema. Pulisci la pelle con salviettine imbevute di alcol per evitare irritazioni.

Per preparare la configurazione dell'imaging, posizionare un termoforo impostato a 37 gradi Celsius sotto l'animale per prevenire l'ipotermia. Allinea la sorgente luminosa e la fotocamera per acquisire immagini di alta qualità. Utilizzare una soluzione di tartrazina 0,65 molare miscelata con gel di agarosio allo 0,3%-0,4% per l'applicazione.

Usando un contagocce, applica la soluzione preparata sulla pelle, sulla pancia o sulla testa, a seconda dell'esperimento. Lasciare riposare la soluzione per alcuni secondi per iniziare l'assorbimento. Ora, con un batuffolo di cotone, strofinare delicatamente l'area di applicazione per distribuire uniformemente la soluzione e migliorare l'assorbimento dermico.

Quindi massaggiare delicatamente l'area con un batuffolo di cotone pulito e applicare altra soluzione secondo necessità. Osservare la comparsa di punti rossi arancioni, che si fonderanno gradualmente in un colore uniforme, indicando la penetrazione del colorante e l'inizio della pulizia ottica. Continua a massaggiare l'area fino a quando la pelle diventa trasparente e gli organi interni sono visibili, il che di solito richiede dai tre ai cinque minuti per una piccola area.

Posizionare delicatamente un vetrino o un vetrino coprioggetti sulla pelle per ridurre la lucentezza della superficie e minimizzare i riflessi. Pulire delicatamente la soluzione colorante dalla pelle utilizzando un batuffolo di cotone o un panno morbido inumidito con acqua. L'effetto di schiaritura ottica si invertirà e la pelle tornerà gradualmente al suo aspetto opaco originale.

Dopo aver spento l'anestesia gassosa, consentire all'animale di riprendere conoscenza. Una volta che l'animale è completamente sveglio e mobile, rimettilo nella sua gabbia di casa. Nel tessuto di petto di pollo ex vivo non trattato, i modelli sottostanti non erano visibili e i dati dello spettrometro hanno mostrato bassi valori di trasmissione che diminuivano con l'aumentare dello spessore del tessuto.

Dopo il trattamento con una soluzione di tartrazina 0,65 molari, i tessuti sono diventati visibilmente trasparenti e i motivi della griglia e del logo sottostanti sono emersi chiaramente. Sono stati osservati anche aumenti sostanziali dei valori di trasmissione in tutti gli spessori dello spettro visibile. Nei topi vivi, l'applicazione di una soluzione di tartrazina molare 0,65 ha permesso la visualizzazione degli organi interni attraverso la pelle entro pochi minuti dal trattamento, mostrando una trasparenza visibilmente maggiore nelle regioni addominali.

La pulizia ottica del cuoio capelluto ha permesso la visualizzazione dei vasi sanguigni cerebrali senza la rimozione chirurgica della pelle, dimostrando l'efficacia della tecnica per l'imaging cerebrale. L'effetto di schiarimento era completamente reversibile. Il risciacquo del tessuto con acqua ha ripristinato l'opacità e l'aspetto normale della pelle è tornato in poche ore, con la ricrescita dei peli osservata per diversi giorni.