Tecnica di iniezione sottoretinica transsclerale minimamente invasiva ottimizzata nel topo

Le iniezioni sottoretiniche sono uno strumento importante per le indagini precliniche sulle terapie per le malattie ereditarie della retina. In questo video, presentiamo una tecnica di iniezione sottoretinica ottimizzata e minimamente invasiva nei topi. Le iniezioni sottoretiniche transsclerali sono un modo eccellente per fornire materiale ai fotorecettori e all'EPR.

Tuttavia, questa tecnica è tecnicamente impegnativa e richiede lo sviluppo di un protocollo ottimizzato per aumentarne la riproducibilità e l'accessibilità. I nostri miglioramenti includono lo sviluppo di uno speculum palpebrale di topo, la somministrazione preoperatoria di atropina, la creazione di una sclerotomia puntiforme utilizzando un coltello diamantato e l'ottimizzazione delle dimensioni dell'ago e dell'approccio all'iniezione. Ci auguriamo che la coerenza, la riproducibilità, l'eccellente copertura di trasduzione e il minimo danno chirurgico del nostro metodo miglioreranno l'accessibilità delle iniezioni sottoretiniche alla comunità scientifica.

Le nostre ottimizzazioni rendono più facile e veloce l'esecuzione di iniezioni sottoretiniche nei topi, riducono la variabilità sperimentale e migliorano le percentuali di successo dell'iniezione. Questa tecnica faciliterà la futura ricerca preclinica traslazionale sulla retina. Per iniziare, somministrare un milligrammo per chilogrammo di atropina intraperitoneale in un volume totale di 50 microlitri 30 minuti prima di eseguire l'iniezione sottoretinica.

Caricare un microago di vetro con il volume desiderato della soluzione iniettabile. Collegare l'ago al microiniettore e impostare la pressione di compensazione a cinque ettopascal per contrastare l'azione capillare. Posizionare il topo anestetizzato sotto uno stereomicroscopio da dissezione.

Applicare una goccia di proparacaina allo 0,5% sull'occhio per ottenere l'anestesia topica. Applicare una goccia di una miscela contenente lo 0,2% di ciclopentolato e l'1% di fenilefrina sull'occhio per dilatare la pupilla per l'imaging postoperatorio della bolla sottoretinica e per ridurre il sanguinamento intraoperatorio. Utilizzando uno speculum a filo metallico in miniatura personalizzato, esporre il fornice superiore e immobilizzare lo speculum per consentire la retrazione della palpebra superiore a mani libere.

Usando le forbici di Vannas angolate, praticare un paio di incisioni limbari a circa un millimetro dietro il limbus nella congiuntiva superiore e nella capsula di Tenone per esporre la sclera superiore. Rimuovere con cautela eventuali residui della capsula di Tenone sopra il sito di iniezione. Ora afferra il bordo anteriore della peritomia congiuntivale e della tenotomia con una pinza dentata bloccante.

Quindi inferodure delicatamente il globo per esporre la sclera superiore. Applicare immediatamente una goccia di soluzione fisiologica tamponata bilanciata sull'occhio per mantenere idratata la sclera nuda e per ottenere un maggiore ingrandimento ottico. Usando un coltello di diamante, esegui una sclerotomia puntuale a circa ore 12 e a uno o due millimetri dal limbus.

Posizionare la lama tangenzialmente alla sclera per assicurarsi che la sclerotomia sia piccola e poco profonda. Utilizzare una spugna chirurgica per rimuovere delicatamente tutta la soluzione salina tamponata bilanciata dalla superficie dell'occhio. Tenere lo smusso dell'ago verso il basso con un angolo poco profondo rispetto alla sclera e inserire lentamente la punta nella sclerotomia, avanzando di soli 0,5-un millimetro per accedere allo spazio sottoretinico senza penetrare nella retina.

Tenendo fermo l'ago, iniziare l'iniezione a 500 ettopascal utilizzando il pedale e mantenere una pressione continua per 15 secondi. Rimuovere l'ago e osservare un reflusso parziale della soluzione iniettata attraverso il sito della sclerotomia, indicando l'avvenuta erogazione poiché lo spazio sottoretinico non può ospitare l'intero volume della soluzione iniettata. Rimuovere con cautela la pinza di bloccaggio e lo speculum palpebrale senza esercitare pressione sul globo per evitare un ulteriore reflusso.

Immediatamente dopo l'iniezione, applicare una generosa quantità di unguento lubrificante per gli occhi sull'occhio per facilitare la visualizzazione delle bolle sottoretiniche. Una bolla sottoretinica era chiaramente visibile sull'OCT subito dopo l'iniezione transsclerale, confermando l'avvenuta somministrazione. Per valutare l'epitelio pigmentato retinico, o RPE, è stato iniettato AAV-8 distrofina 1-GFP, con conseguente diffusa fluorescenza verde in tutto lo strato di epitelio, indicando una trasduzione efficiente e ampia dell'RPE utilizzando l'approccio transsclerale.

La GFP della rodopsina AAV-8 ha portato a un forte segnale fluorescente verde nei fotorecettori dei bastoncelli, visibile sia nelle sezioni trasversali che nel fondo oculare, indicando il successo del targeting e dell'espressione nelle cellule fotorecettoriali. AAV8-CAG-mCherry ha prodotto un'ampia fluorescenza rossa attraverso gli strati retinici, dimostrando la capacità di questa tecnica di supportare l'espressione generalizzata del transgene oltre a specifici tipi di cellule. Il western blotting dei lisati retinici ha anche mostrato una forte espressione proteica fluorescente verde con i livelli più alti corrispondenti al centro della bolla di iniezione, convalidando la trasduzione dei fotorecettori con AAV8 rodopsina GFP.

L'ottimizzazione del titolo AAV mediante analisi in immunofluorescenza delle sezioni retiniche consente la selezione del titolo virale che raggiunge la trasduzione di circa il 90% delle cellule bersaglio. Ad esempio, in questo caso, una diluizione da uno a 10 di un ceppo virale di GFP di rodopsina AAV8 ha prodotto l'espressione di un transgene in quasi tutti i fotorecettori. Al contrario, una diluizione da uno a 100 ha portato a un tasso di trasduzione insufficiente.

L'elettroretinogramma ha mostrato che le iniezioni transsclerali preservano la normale funzione retinica, mentre le iniezioni transretiniche portano a una riduzione significativa delle risposte delle onde A e B, indicando un danno retinico.