Produzione basata su microbioreattori di cellule stromali mesenchimali dipendenti dall'ancoraggio, preparate per la sindrome da difficoltà respiratoria acuta

Studiamo come le cellule interagiscono con il loro ambiente, incluso quando producono o producono cellule come terapie. Qui, affrontiamo domande su come cellule dipendenti dall'ancoraggio come le MSC, lo stromale mesenchimale o le cellule staminali possano essere prodotte per superare alcune barriere alla traduzione clinica. Il crescente riconoscimento della variabilità della popolazione cellulare influisce sia sulla consistenza che sulla potenza del prodotto cellulare finale per ogni lotto o persona.

Queste sfide possono persino influire sull'approvazione regolatoria di alcune terapie cellulari. Miriamo a un gap che possa raggiungere un alto numero di celle per millilitro di fluido con un alto controllo dell'ambiente e in modo da poter essere ampliato. Questo protocollo offre un modo per includere il monitoraggio ambientale inline per cellule dipendenti dall'ancoraggio, come le MSC.

Questo controllo del processo è un vantaggio rispetto alle fiaschette ancora utilizzate nella maggior parte della produzione in laboratorio e clinica. Ci sono diverse domande aperte per le MSC e altri tipi cellulari sensibili ai segnali meccanici. Ad esempio, come può questo tipo di approccio aiutare a ingegnerizzare le cellule per affrontare altri stati patologici?

Per cominciare, rimuovi il tappo di plastica trasparente collegato alla bottiglia LL nel portabottiglie. Utilizzando una nuova siringa sterile da 50 millilitri senza pistone, collega l'ugello alla bottiglia LL. Versa l'acqua filtrata sterile nel cilindro della siringa e iniettala nella bottiglia LL. Allo stesso modo, riempi la bottiglia L con 25 millilitri di DMEM a basso contenuto di glucosio senza FBS, la bottiglia R con 25 millilitri di PBS sterile e la bottiglia RR con otto millilitri di soluzione di risciacquo antiaderente. Ripeti la procedura per preparare il numero richiesto di consumabili per l'esperimento.

Successivamente, esegui un autotest su ogni capsula da utilizzare nell'esperimento. Una volta che la capsula ha superato con successo tutti i controlli dell'auto-test, rimuovi le cassette auto-test e mettile in sacchetti di conservazione protetti dalla luce. Monta il consumabile sul bioreattore.

Rimuovi il nastro verde dalle valvole dei consumabili e installa il consumabile nel capsulo. Reinstalla le morsette e controlla eventuali sibili per confermare che la guarnizione sia ben fissata. Collega la linea bianca del sensore di pressione, la linea di pressione dell'aria rossa e la linea blu del vuoto tra il consumabile e la stazione base o la capsula.

Conferma che la porta di iniezione laterale sia chiusa con una pinza bianca a goccia lacrimale prima di iniziare un nuovo esperimento. Clicca sull'icona Flush Bottles nell'interfaccia software. Attiva il pulsante radio per la bottiglia L, seleziona Output to Waste, poi clicca Start Flush MSCserum.

Nella finestra Contenuto della bottiglia, indica che MSCserum si trova nella bottiglia R, che contiene PBS. Poi naviga in Operazioni Manuali ed esegui tre cicli di Eject Wash sulla bottiglia di scarto. Nella finestra del Contenuto della bottiglia indica che MSCserum ora si trova nella bottiglia RR, che contiene la soluzione antiaderente per risciacquo.

Torna alle Operazioni Manuali ed esegui un ciclo di Eject-Wash sulla bottiglia di scarto. Dopo 30 minuti, risciacqua il consumabile con PBS. Svuota il reattore in attesa dell'iniezione di cellule e microportatori.

Nel pannello Operazioni Manuali clicca Riinocula. Lascia il sistema in pausa nella fase in cui il cruscotto mostra un prompt per vaccinare il reattore. Successivamente, pipettare un volume calcolato di cellule risospese in un tubo conico da 15 millilitri contenente microportatori per ogni condizione.

Riempi ogni tubo a un volume compreso tra 2,2 e 2,5 millilitri con un mezzo cellulare mesenchimatose umano fresco e caldo. Lavorando con uno o due consumabili alla volta, rimuovili dalla stazione base e portali nell'armadietto di biosicurezza. Preleva la miscela di cellula e microtrasportatore in una siringa da cinque millilitri usando un ago smussato verde da quattro pollici.

Iniettare la miscela nel reattore. Afferra la linea della porta di iniezione vicino alla base della cassetta facendo attenzione a non staccare la linea. Utilizzando un movimento rotante tra pollice e indice, ruota la linea del foro di iniezione per due rotazioni complete per creare una piega annodata nella linea.

Rifila il nodo nello spazio di apertura vicino alla base della porta di iniezione e fissalo con un piccolo pezzo di nastro da laboratorio. Poi riporta il consumabile alla stazione base. Dopo aver ripetuto l'iniezione per tutti i consumabili, naviga attraverso l'interfaccia software per indicare che l'inoculazione è completa.

Quando il software torna sulla homepage, rimuovere la pinza bianca dalle linee di uscita dei consumabili. Entra in Manual Ops ed esegui la funzione Eject Excess con la porta di uscita impostata su P per la perfusione. Attiva la modalità di miscelazione statica usando un ciclo di 1.680 secondi acceso e 120 secondi spento, e imposta la frequenza di miscelazione a cinque hertz.

Per iniziare il prelievo cellulare, si utilizza una siringa da un millilitro per prelevare 200 microlitri di Pronasi e circa 300-400 microlitri d'aria. Svita il tappo sulla linea di iniezione laterale e spruzza il connettore della valvola senza ago con etanolo al 70%. Rimuovi il nastro dalla linea di iniezione laterale annodata, sciogli il nodo e sblocca la morsa bianca a goccia.

Ora, collega la siringa da un millilitro e inietta delicatamente la Pronasi nel reattore. Insegui il liquido con aria per assicurare una consegna completa. Riavvicina la morsa a goccia e ricappuccia la linea di iniezione.

Poi rimetti il consumabile nella capsula, ricollega tutte le linee, rimuovi la pinza a C bianca e riprendi la miscelazione. Metti la bottiglia di rifiuti e quella della fonte di supporto sul ghiaccio. Avvia un timer di cinque minuti e lascia che la Pronasi digera i microportatori nel reattore.

Dopo cinque minuti, verifica che i microportatori si siano degradati controllando la loro assenza nel reattore. Raccogli le celle entrando in Operazioni Manuali, imposta il numero di cicli a tre, scegli Porta di Uscita W per i rifiuti e clicca su Espulsa Lavaggio. Dopo il completamento dei cicli di lavaggio espulso, trasferire il consumabile nell'armadietto di biosicurezza.

Poi si ritira il contenuto della bottiglia di scarto usando una siringa da 10 o 20 millilitri. Distribuire il contenuto della bottiglia di rifiuti in un tubo centrifuga conico da 15 millilitri. Centrifuga le celle a 300g per cinque minuti.

Aspirare il soprandanante e valutare la dimensione del pellet cellulare. Le condizioni ambientali, tra cui pH, temperatura, ossigeno disciolto e anidride carbonica, sono state mantenute stabilmente per tutto il periodo di coltura di 10 giorni nel sistema microbioreatore. La variazione del pH era significativamente inferiore nel microbioreattore rispetto alla condizione della fiaschetta in polistirene in coltura tissutale.

La resa cellulare era superiore nel microbioreatore rispetto al fiaschetta T25, mantenendo però una vitalità cellulare simile. Dei 14 attributi critici di qualità associati alla potenza misurati, nove hanno mostrato un'espressione significativamente più alta dell'mRNA nella condizione del microbioreattore rispetto al fiaschone T75.