Esplorazione delle interazioni proteina-glicano: progressi nella risonanza magnetica nucleare

Studiamo le interazioni proteina-proteina e proteina-glicano, concentrandoci sul complesso integrina-disintegrina. Il nostro modello esplora le dinamiche strutturali e mette in evidenza il ruolo della forza superficiale nella mediazione della formazione complessa e della stabilità dell'interazione. Il nostro gruppo si dedica allo studio del ruolo delle forze di superficie nel riconoscimento molecolare e nell'evoluzione dei siti di legame attraverso lo studio dei cluster idrofobici superficiali presenti nelle proteine.

La soluzione NMR consente il rilevamento delle interazioni proteiche. Sebbene le interazioni deboli siano essenziali per la vita, c'è una tendenza verso i complessi ad alta affinità, anche se sono presenti in molte importanti funzioni biologiche. Il nostro gruppo si sta concentrando sull'utilizzo di approcci di biologia strutturale integrativa per studiare grandi complessi proteici.

Stiamo utilizzando la risonanza magnetica mobile come strumento principale per studiare la dinamica e gli aspetti funzionali. Per iniziare, preparare una soluzione di quattro millimolari di D-mannosio in tampone fosfato di sodio a pH 7,4 con 50 millimolari di cloruro di sodio e 5% di ossido di deuterio. Dividere la soluzione in due campioni, uno contenente 80 micromolari CVN e il secondo senza.

Per mappare il legame del ligando attraverso la perturbazione dello spostamento chimico sullo spettrometro NMR, impostare la sequenza di impulsi HSQCTOPSI per l'acquisizione di H1C13 HSQC. Configura il dominio del tempo, l'ampiezza spettrale, la frequenza della portante e il numero di scansioni. Calcola la perturbazione dello spostamento chimico utilizzando l'equazione fornita.

Per mappare il legame del ligando attraverso la differenza di trasferimento di saturazione, creare prima un nuovo set di dati. Configura i parametri per gli esperimenti MRN STD esaminando diverse frequenze di saturazione o fissando la frequenza mentre vari i tempi di saturazione per valutare l'accumulo. Imposta gli esperimenti NMR 1D H1 utilizzando la sequenza di impulsi ZGPR.

Sintonizzare lo spettrometro su H1, eseguire lo shimming e misurare un impulso forte di 90 gradi. Centrare la frequenza portante a circa 4,7 parti per milione, corrispondente al segnale dell'acqua, quindi selezionare STDDIFFESGP. 3 impulsi e impostare i parametri di acquisizione.

Impostare l'ampiezza spettrale come richiesto, il ritardo di interscansione D1 a quattro secondi e definire il tempo di saturazione D20, secondo gli obiettivi dell'esperimento. Carica l'elenco FQ2 con frequenza di fuori risonanza a meno 40 parti per milione e frequenze di risonanza per saturare solo le proteine. Testare le frequenze di risonanza in conduzione di meno 0,59, 0,73 e 8,1 parti per milione per determinare le condizioni ottimali.

Utilizzare la frequenza ottimale per acquisire spettri STD a tempi di saturazione di 0,5, uno, 1,5, due, 2,5, tre e quattro secondi. Tracciare i valori ASTD corrispondenti in funzione del tempo di saturazione. Ora, imposta il numero di scansioni su 64 e calcola la media del ciclo dell'esperimento quattro volte.

Quindi, calcola il numero totale di scansioni. Impostare il ritardo dell'interscansione su quattro secondi e il tempo di acquisizione su 2,7262976 secondi. Configura l'impulso di saturazione impostando la durata a 50 millisecondi e il controllo della forma gaussiana tramite il programma sagomato 9SP9.

Applicare un filtro di riga T1 nella variante MRR STD, quindi impostare il tempo di blocco della rotazione D29 in base alla dimensione della proteina. Per mappare il legante H1 R2, selezionare innanzitutto il programma di impulsi CPMG_ESGP2D dalla libreria standard Bruker. Impostare l'esperimento come acquisizione 2D.

Configurare i parametri di acquisizione come mostrato. Quindi, esegui l'esperimento per 200 cicli di otto scansioni ciascuno. Regolare l'elenco dei contatori variabili in base al tempo totale desiderato del ciclo CPMG.

Esegui due esperimenti, uno per il campione con la proteina e uno per il campione di solo ligando. Tracciare gli spettri H1 per ogni TCPMG utilizzando il comando EFP o seno M seguito da FP, quindi regolare la funzione finestra in base alla migliore strategia di elaborazione. Calcola il quoziente CPMG Q usando l'equazione.

Acquisisci H1N15HSQC spettri di CVN marcato con N15 a 298 Kelvin. Titolare con D-mannosio per raggiungere le concentrazioni finali di zero, uno, due, cinque, 10, 20, 40 e 60 millimoli. Utilizza la sequenza di impulsi HSQC veloce FHSQCF3GPPH sensibile alla fase dalla libreria standard Bruker.

Quindi, calcola la perturbazione dello spostamento chimico usando la formula. Tracciare i valori CSP per ciascun residuo in funzione della concentrazione di D-mannosio per determinare la costante di dissociazione KD utilizzando l'equazione cinque. Quindi, adattare i dati risultanti a una singola isoterma di legame utilizzando la formula.

Utilizzare la sequenza di impulsi HSQCT2ETF3GPSI3D sensibili alla fase e configurare i parametri come mostrato per misurare i valori N15 R2 dei singoli residui di CVN in assenza e presenza di 60 millimolari di D-mannosio a 298 Kelvin. Elabora spettri pseudo-tridimensionali utilizzando NMRPipe per generare spettri simili a HSQC per ogni ritardo di rilassamento. Importare gli spettri elaborati in una piattaforma di analisi.

Quindi, seleziona tutti gli spettri e applica lo strumento Segui modifiche di intensità. Tracciare l'intensità di ciascun picco incrociato in funzione del rilassamento T e adattare il decadimento a una funzione monoesponenziale per estrarre i valori N15 R2 per ogni residuo. Calcolare l'errore sperimentale dal rapporto segnale/rumore degli spettri simili a HSQC a 67,84 millisecondi.

Elabora una regione dello spettro contenente solo rumore e convertila in un file di testo utilizzando il comando dato. Quindi, determinare la deviazione standard della regione di rumore o l'intensità del rumore utilizzando un software statistico. Calcola l'errore sperimentale utilizzando l'equazione data.

Perturbazioni dello spostamento chimico sono state osservate per entrambe le forme anomeriche di D-mannosio in presenza di CVN, con spostamenti maggiori osservati nel beta-D-mannosio, indicando un legame preferenziale. Due picchi distinti sono stati osservati per la maggior parte degli idrogeni D-mannosio in presenza di CVN, corrispondenti agli stati liberi e legati. I nuclei di idrogeno che mostravano i valori più alti di ASTD erano associati al beta-D-mannosio, coerentemente con forti interazioni bipolari con CVN.

Nell'analisi del tasso di rilassamento trasverso, l'H beta quattro è stato l'unico protone che ha mostrato un notevole aumento del rilassamento dopo il legame con la CVN. Le perturbazioni di spostamento chimico H1 e N15 indotte dall'aggiunta di un ligando erano più alte a concentrazioni fino a 10 millimolari. I residui I40, E41, N42, V43, D44 e G45 all'interno del filamento beta hanno mostrato significative perturbazioni dello spostamento chimico, identificandoli come il sito di legame ad alta affinità per il D-mannosio.

Le isoterme di legame hanno mostrato che il residuo D44 aveva la più alta affinità tra i residui del filamento beta, con una costante di dissociazione di circa un millimolare. La misurazione dei tassi di rilassamento di N15 R2 ha mostrato sia aumenti che diminuzioni dei valori di delta R2 dopo il legame con il D-mannosio, suggerendo un mix di stabilizzazione conformazionale e processi di scambio. I residui C58, R59, K74 e R76 hanno dimostrato un aumento dei valori di delta R2, confermando il loro coinvolgimento nel sito di legame ad alta affinità, mentre i residui F4, C8, R24 e G27 rappresentavano la regione a bassa affinità.