Linfodenectomia mesenterica murina per interruzione selettiva della comunicazione linfatica con intestino specifico per regione

La nostra ricerca si concentra sulle risposte delle cellule T ai neoantigeni e ai tessuti periferici, e queste risposte sono fortemente influenzate dal priming, quindi ci concentriamo principalmente su dove si verificano questi eventi di priming. Attualmente, le uniche opzioni ampiamente utilizzate per bloccare il traffico tra linfonodi e tessuti sono le modalità sistemiche come gli agonisti del recettore S1P e il blocco dell'integrina. Ma questa ampia inibizione ci impedisce di studiare il contributo di specifici linfonodi locali.

Il nostro protocollo fornisce una descrizione approfondita delle linfadesnectomie altamente selettive in ciascuna delle quattro principali stazioni dei linfonodi mesenterici e, poiché questi linfonodi sono molto specializzati nel segmento intestinale che drenano, questa procedura di sopravvivenza ben tollerata ci permette di interrompere segmenti specifici dell'asse linfatico intestinale lasciando intatto il resto. Dopo aver confermato la profondità anestetica adeguata con una pizzicatura al piede posteriore, si utilizzano forbici chirurgiche sterili per eseguire un'incisione cutanea da 0,5 a 1 centimetro nella linea centrale del topo anestetizzato. Utilizzando pinze sterili, seziona la pelle lontano dalla parete addominale e identifica la linea alba.

Poi effettuare un'altra incisione da 0,5 a 1 centimetro attraverso la linea alba per accedere alla cavità peritoneale. Utilizzando un ago a punta smussata, inietta un millilitro di soluzione salina sterile a temperatura corporea nella cavità peritoneale. Inumidisce le tende sterili per prepararle alla posizione intestinale.

Per resezionare la prima stazione linfonodale, orientare l'intestino esternalizzato su tende umide con il ceco posizionato inferiormente, il colon prossimale superiore e l'ileo terminale verso il chirurgo. Identifica la catena dei linfonodi mesenterici che corre longitudinalmente lungo il colon. Utilizzando pinze inclinate a punta fine, seziona in modo diretto la prima stazione linfonodale, allontanandosi dai vasi ileocolici posizionando le pinze chiuse tra queste strutture e aprendole delicatamente.

Per ridurre il rischio teorico di flusso collaterale verso i linfonodi vicini, eseguire una legatura opzionale con suture singole interrotte lungo la catena linfonica, un millimetro distale e un millimetro prossimale alla prima stazione linfonodale, utilizzando suture monofilamento in nylon e pinze a punta fine. Ritrai delicatamente la stazione linfonodale caudalmente, poi con forbici a punta fine estrai la stazione linfonodale bersaglio dalla direzione cefalade a quella caudale. Osserva i rami distali dei vasi ileocolici, ileali e dei vasi jejunali per confermare che l'apporto sanguigno sia rimasto intatto.

Per resezionare la seconda stazione linfonodale, eviscerare delicatamente l'intestino tenue e orientare l'intestino esteriorizzato su tende umidite con il ceco posizionato inferiormente, il colon prossimale superiore e l'intestino tenue verso destra del chirurgo. Successivamente, identifica la seconda stazione linfonofodica che corre longitudinalmente lungo il colon e inizia alla confluenza dei vasi ileali e jejunali. Utilizzando pinze angolate e con punta fine, sezionare in modo diretto la seconda stazione linfonofodica, lontano dai vasi colonici.

Per ridurre il rischio teorico di flusso collaterale verso i linfonodi vicini, eseguire una legatura opzionale con suture singole interrotte lungo la catena linfonica, un millimetro distale e un millimetro prossimale alla seconda stazione linfonodale, utilizzando suture monofilamento in nylon e pinze a punta fine. Ritrai delicatamente la stazione linfonodale caudalmente, poi con forbici a punta fine, elimina la seconda stazione linfonodicale dalla direzione cefalade a quella caudale. Ispezionare il campo operatorio per assicurarsi l'emostasi.

Per resezionare la quarta stazione linfonodale, eviscerare delicatamente l'intero intestino tenue fino al punto di ancoraggio posteriore. Orientare l'intestino su tende umide con il ceco inferiore, il colon prossimale superiore e l'intestino tenue verso destra del chirurgo. Identifica la quarta stazione linfonodale, che si trova appena medialmente al colon distale e lateralmente alla terza stazione.

Utilizzando pinze inclinate a punta fine o forbici a punta extra-fine, seziona in modo diretto la quarta stazione linfonodale, lontano dai vasi colonici e dal tessuto adiposo circostante. Per ridurre il rischio teorico di flusso collaterale verso i linfonodi vicini, eseguire una legatura opzionale con suture singole interrotte a ciascun linfonodo identificabile, solitamente a un millimetro dal linfonodo, utilizzando suture in nylon monofilamento e pinze a punta fine. Poi ritrai delicatamente la quarta stazione linfonodica, cefala.

Utilizzando forbici a punta fine o extra-fine, eliminare le stazioni dei linfonodi, dalla caudale a quella cefalada. Ripeti la procedura per il secondo linfonodo nella quarta stazione linfonodale. Dissezionare con attenzione il nodo, eseguire la legatura con suture se necessario e resezionarlo.

Ispezionare il campo operatorio per confermare l'emostasi. Dopo aver riportato il contenuto addominale nella cavità peritoneale, si infonda un millilitro di soluzione salina sterile a temperatura corporea nella cavità addominale per compensare la perdita di liquido evaporativo. Chiudi l'addome in due strati: prima la parete addominale, poi la pelle usando una sutura monofilamento in polipropilene 6-0 in un pattern di corsa.

Il tessuto estratto tramite la procedura di linfadenectomia mesenterica ha costantemente prodotto campioni con basso contenuto adiposo, come dimostrato dall'immediato affondamento nel PBS. L'analisi della citometria a flusso ha confermato il successo dell'estrazione dei linfonodi, con oltre il 95% delle cellule nei campioni derivati dalla linfadenectomia mesenterica identificate come CD45 positive, rispetto al solo 7% nei controlli viscerali del tessuto adiposo.