Name: Miglioramento dellediting del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Scopri il metodo I-GONAD per l'editing genomico in utero mediante elettroporazione nei topi. Questa tecnica computazionale riduce l'uso di animali e semplifica la generazione di knockout con efficienza comparabile alla microiniezione.

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<ol><li>Fujihara, Y., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Genome+Editing+in+Mice+by+Single+Plasmid+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection.</a> Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+complete+gene+knockout+mice+and+monkeys+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+with+multiple+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs.</a> Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+i-GONAD+suitable+for+production+of+genome-edited+C57BL%2F6+inbred+mouse+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain.</a> Cells. 9 (4), 957(2020).</li>
<li>Takabayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+i-GONAD+in+mice+at+early+zygote+stage+through+in+vivo+electroporation+three+minutes+after+intra-oviductal+instillation+of+CRISPR-ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+i-GONAD%3A+An+improved+in+vivo+technique+for+CRISPR%2FCas9-based+genetic+manipulations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice.</a> Cells. 9 (3), 546(2020).</li>
<li>Kessler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+super-enhancer+region+establishes+inter-TAD+interactions+and+controls+Hoxa+function+in+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest.</a> Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).</li>
<li>Kaneko, T., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+genome+editing+by+electroporation+using+embryos+artificially+removed+cumulus+cells+in+the+oviducts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts.</a> Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((i-GONAD%3A+A+robust+method+for+in+situ+germline+genome+engineering+using+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases.</a> Genome Biol. 19 (1), 25(2018).</li>
<li>Marshall, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PerlPrimer%3A+Cross-platform%2C+graphical+primer+design+for+standard%2C+bisulphite+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR.</a> Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+evaluation+of+CRISPR+genome+editing+by+TIDE+and+TIDER%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Gene+Editing%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER.</a> CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).</li>
<li>Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+wild+strains+of+mice+using+the+i-GONAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method.</a> Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).</li>
<li>Iwata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+large-scale+chromosomal+engineering+of+mouse+zygotes+viain+vitro+and+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation.</a> Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).</li>
<li>Abe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+large-fragment+knock-in+animal+production+without+ex+vivo+handling+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes.</a> Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).</li>
<li>Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+cortical+electroporation+of+plasmids+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5&ndash; 5 uL pipette&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642020</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da 1,5 mL</td><td>Aptaca</td><td>1003/G</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 uL pipette &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da 200 uL</td><td>Assigeno</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>20-200 uL pipetta &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>2-20 uL pipetta&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>4x Colorante di Carico in Gel</td><td>Biolabmix</td><td>D-3002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I, senza RNasi (1 U/&mu; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Set dNTP, soluzione da 100 mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA Polimerasi (5 U/&mu; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s soluzione salina tamponata fosfato modificata</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Analisi ICE di EditCo</td><td>https://ice.editco.bio/#/</td><td></td><td>consultato il 06.04.2025</td></tr><tr><td>Soluzione EDTA 0,5M, pH = 8</td><td>AppliChem</td><td>A4892.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>&nbsp; https://www.ensembl.org/index.html</td><td></td><td>consultato il 09.06.2025</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Biolabmix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>Gocce per gli occhi " Oftagel"</td><td>URSAPHARM</td><td>204604</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di documentazione gel ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>In-Silico PCR V39x1&nbsp;</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr</td><td></td><td>&nbsp; consultato il 09.06.2025</td></tr><tr><td>Tecnologie Integrate del DNA & nbsp;</td><td>https://eu.idtdna.com</td><td></td><td>consultato il 09.06.2025</td></tr><tr><td>Forbici microchirurgiche</td><td>Medin URAL</td><td>M124</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore NEPA21</td><td>Nepa Gene</td><td>NEPA21</td><td>Con un elettrodo CUY652P2,5X4</td></tr><tr><td>NTP Set, soluzione da 100 mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotidi</td><td>Evrogen</td><td></td><td>Purificazione standard a ordine diretto e desalinizzazione</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medium Siero Ridotto</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PerlPrimer</td><td>https://perlprimer.sourceforge.net</td><td></td><td>Versione 1.1.21.</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà (2 U/&mu; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530L</td><td></td></tr><tr><td>Punte da 10 uL per pipetta</td><td>Ulplast</td><td>HT-10-960</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 1000 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-1000-576</td><td></td></tr><tr><td>Punte pipette da 200 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-200-960</td><td></td></tr><tr><td>Alimentazione " Elf-4"</td><td>Tecnologia del DNA</td><td>PS-400 NUOVO</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di RNAsi/DNAsi</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>PanEco</td><td>P011n</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi horisontale SE-1</td><td>Elicon</td><td>SE-1</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Scala del DNA Step100</td><td>Biolabmix</td><td>S-8100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio SMZ1000</td><td>Nikon</td><td>5-363376</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetter sfilatore</td><td>CooperSurgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>Punte per spogliarelliste</td><td>ORIGIO</td><td>MXL3-125</td><td></td></tr><tr><td>Ago chirurgico &nbsp;</td><td>KMIZ</td><td>4A1- 0,6 e volte; 20</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per suture</td><td>Medin URAL</td><td>M302.2</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per suture</td><td>Medin URAL</td><td>M303</td><td></td></tr><tr><td>Filo di sutura POLYCON N<img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/68704/68704eq1.jpg" style="margin: auto; "/>0</td><td>Tonzos 95</td><td>234</td><td></td></tr><tr><td>Guida SYNTHEGO Knockout Design & nbsp;</td><td>https://design.synthego.com/#/</td><td></td><td>consultato il 09.06.2025</td></tr><tr><td>Amplificatore T100</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerasi &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>Buffer TBE 10x</td><td>Biolabmix</td><td>TBE-500</td><td></td></tr><tr><td>Tide&nbsp;</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td>consultato il 04.06.2025&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris cloruro</td><td>Suzhou Yacoo Scienza</td><td>SYS-S0005-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloridrato di Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2663</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Proteina Cas9 TrueCut</td><td>Invitrogen</td><td>A36499</td><td></td></tr><tr><td>Forbici universali</td><td>Medin URAL</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Interchemie Werken de Adelaar</td><td>IX2</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Laboratorio Virbac</td><td>2000443714739.00</td><td></td></tr></tbody></table>

miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery-based In Vivo Electroporation Technique for Knockout Mice Generation

Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

Methods for creating knockout mice typically involve three main steps: (1) collecting embryos from donor females, (2) microinjecting genetic constructs ...

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Per valutare la funzione e la regolazione dei geni durante lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalo, si descrive un metodo che...

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Nucleasi di stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFNs) e attivatore di trascrizione come nucleases effettrici (Talens) possono essere utilizzati per modificare il genoma di embrioni preimpianto di topo attivando sia la fine nonhomologous giunzione (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) percorsi. Questi progressi consentono la rapida generazione di mouse con precise modificazioni genetiche.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l'uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Il presente protocollo descrive la microiniezione di zigote di CRISPR-Cas9 e DNA del donatore per produrre in modo efficiente topi knock-in e floxed con cassette geniche.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un'efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di modelli murini geneticamente modificati utilizzando cellule staminali embrionali, in particolare per il knock-in del DNA di grandi dimensioni (KI). Questo protocollo è ottimizzato utilizzando l'editing del genoma CRISPR / Cas9, con conseguente miglioramento significativo dell'efficienza KI rispetto al tradizionale metodo di targeting linearizzato del DNA mediato dalla ricombinazione omologa.

Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

Questo protocollo descrive la microiniezione e l'elettroporazione in vivo per l'editing del genoma mediato da CRISPR limitato a livello regionale nell'ovidotto del topo.

Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo

Questo protocollo presenta un approccio ottimizzato per la produzione di modelli di ratto geneticamente modificati. Il virus adeno-associato (AAV) viene utilizzato per fornire un modello di riparazione del DNA e l'elettroporazione viene utilizzata per fornire reagenti CRISPR-Cas9 per completare il processo di editing del genoma nell'embrione a 2 cellule.

Editing del genoma CRISPR-Cas9 di embrioni di ratto utilizzando il virus adeno-associato (AAV) e l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

Scopri il metodo I-GONAD per l'editing genomico in utero mediante elettroporazione nei topi. Questa tecnica computazionale riduce l'uso di animali e semplifica la generazione di knockout con efficienza comparabile alla microiniezione.

Miglioramento dellediting del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout (Video) | JoVE Journal

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