Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

L'ambito della nostra ricerca è semplificare la generazione dei topi knockout utilizzando l'elettroporazione in utero, che fornisce componenti di editing genomico direttamente negli ovidotti delle femmine incinte. Le micro-iniezioni negli zigoti richiedono il mantenimento di un gran numero di animali, inclusi donatori e riceventi femmine e maschi vasectomizzati. Pertanto, sono preferibili protocolli che minimizzino l'uso degli animali.

L'uso del sistema Nepa21 per l'elettroporazione degli zigoti offre un'opportunità unica per generare topi knockout genici mirati in un unico passaggio, con un'efficienza paragonabile a quelle delle tecniche standard basate sull'iniezione nucleare. Per cominciare, si utilizzano strumenti di analisi computazionale per identificare potenziali sequenze di RNA guida singola che mirano al gene selezionato di interesse. Seleziona sequenze situate negli esoni il più vicino possibile al sito desiderato della mutazione. Usa un browser genomico per incrociare la struttura dell'esoma e dare priorità alle sequenze presenti nella maggior parte delle isoforme di splice.

Analizza l'attività prevista fuori obiettivo di ogni sequenza guida utilizzando il sistema integrato di punteggio dello strumento. Scegli sequenze che dimostrino la probabilità più bassa di un legame fuori bersaglio. Per produrre un template lineare di DNA a doppio filamento, si prepara il master mix PCR utilizzando i componenti specificati nella tabella fornita.

Aggiungi la polimerasi per ultimo e tieni il mix master sul ghiaccio per mantenere la stabilità enzimatica. Poi, esegui la PCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclo termico. Successivamente, prepara il master mix di trascrizione in vitro utilizzando i componenti forniti e incuba la reazione per 1,5 ore a 37 gradi Celsius utilizzando un termociclatore per un controllo costante della temperatura.

Poi, aggiungi due microlitri di DNasi I alla reazione. Incubare a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti per digerire il modello del DNA, poi inattivare l'enzima a 75 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo la purificazione dell'RNA con Trizol, si misura la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e si verificano i rapporti A260-A280 e A260-A230.

Per preparare il complesso ribonucleoproteico alla trasfezione, diluire un tampone molare Tris-HCl a una concentrazione di 100 millimolari utilizzando acqua priva di nucleasi. Filtra la soluzione usando un filtro a siringa con poro di 0,022 micrometri. Aloquota in porzioni da 10 microlitri e conserva a quattro gradi Celsius fino all'uso.

Successivamente, preparare la miscela di trasfezione utilizzando nucleasi spCas9, RNA guida singola e Tris-HCl diluiti con acqua DEPC in un tubo privo di nucleasi. Incubare la miscela di trasfezione a 37 gradi Celsius per 10 minuti per permettere la formazione del complesso ribonucleoproteico. Poi, si tratta di aliquota la miscela di trasfezione in piccoli volumi adatti a sessioni singole di I-GONAD e di mantenerla a quattro gradi Celsius per preservare l'attività dei reagenti.

Dopo aver accoppiato le femmine di topo CD1 con maschi di CD1 con un singolo stazio durante la notte, controlla la presenza di un plug copulante per ogni femmina. Trasferire solo le femmine con tappi visibili in una nuova gabbia per ulteriori procedure sperimentali. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox per garantire la sterilità prima dell'uso.

Poi, pesa il plug selezionato=topi femmina positivi usando una bilancia elettronica prima di anestetizzarli. Monitorare i topi anestetizzati per la perdita del riflesso di pizzicare del dito del piede per confermare un'adeguata anestesia. Posiziona il mouse su una borsa riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante la procedura.

Successivamente, applica un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Con forbici fini, eseguire un'incisione longitudinale di 0,7 centimetri nella pelle della zona lombare. Poi, apri lateralmente le punte leggermente aperte delle forbici per estendere delicatamente l'incisione cutanea a circa 1,3 centimetri.

Successivamente, effettuare con attenzione un'incisione di 0,7 centimetri nel peritoneo per esporre la cavità addominale. Estendi l'incisione peritoneale a 1,1 centimetri, spingendo bilateralmente con le punte delle forbici leggermente aperte. Individua il cuscinetto adiposo collegato all'ovaio e tiralo delicatamente verso l'esterno usando una pinza finché ovaio, ovidotto e utero non saranno esposti.

Usando una pinza vasiale, fissa il cuscinetto adiposo per stabilizzare le strutture riproduttive. Successivamente, carica due microlitri della miscela di iniezione di ribonucleoproteine in un capillare plastico usa e getta usando un caruttero scortico. Usando microforbici, fai un'incisione di 0,2 centimetri nella parete dell'ovidotto a pochi millimetri a monte dell'ampola.

Inserire il capillare di plastica attaccato alla pipettatrice sfilante nell'incisione dell'ovidotto ed espellere con cura la miscela di iniezione senza introdurre aria. Ritira delicatamente il capillare plastico dall'ovidotto per completare l'iniezione. Accendi l'elettroporatore premendo l'interruttore di alimentazione sul pannello frontale.

Imposta i parametri di elettroporazione sul dispositivo come mostrato sullo schermo. Utilizzando elettrodi tipo pinzetta, afferra delicatamente l'ovidotto e premi il pulsante Kiloohm per misurare la resistenza. Immediatamente dopo la misurazione della resistenza, premi il pulsante Start per iniziare l'elettroporazione e attendi che appaia il segnale finale sul pulsante Ohm.

Dopo l'elettroporazione del primo ovidotto, si riporta delicatamente il tratto riproduttivo nella cavità addominale. Chiudi l'incisione usando sutura chirurgica all'acido poliglicolico 4-0. Per la genotipazione, progettare primer lunghi da 18 a 21 nucleotidi con una temperatura di fusione vicina a 60 gradi Celsius per generare un prodotto PCR da 300 a 600 coppie di base.

Per confermare la specificità di ogni primer, si effettua una ricerca BLAST nel database genomico del topo per eliminare il rischio di amplificazione aspecifica. Successivamente, per l'estrazione del DNA, utilizzando un perforatore per le orecchie, si raccoglie un piccolo campione di tessuto di circa due millimetri dall'orecchio del topo. Aggiungi 100 microlitri di tampone per la lisi.

Incubare il campione a 95 gradi Celsius per 60 minuti, vorticando ogni 20 minuti per garantire una lisi efficiente. Dopo aver eseguito il sequenziamento Sanger, analizza i risultati per valutare gli esiti dell'editing genomico. Per utilizzare l'analisi ICE, carica entrambi i file di sequenziamento Sanger, inserisci la sequenza guida RNA e seleziona la nucleasi appropriata utilizzata nell'esperimento CRISPR.

Successivamente, per utilizzare TIDE, carica i file di controllo e di sequenziamento sperimentale in formato AB1 e inserisci la sequenza guida RNA. L'analisi ICE ha rilevato tre varianti indel distinte nel sito di taglio Cas9: una delezione di una coppia di basi nel 42% delle sequenze, una delezione di tre coppie di basi nel 25% delle sequenze e una delezione di 23 coppie di basi nel 27% delle sequenze. Il valore di adattamento del modello era 0,94 e il punteggio knockout 69, indicando una forte correlazione prevista e probabile knockout genetico.

I cromatogrammi di sequenza hanno confermato una interruzione nel sito di taglio Cas9 nel campione modificato, mentre il cromatogramma di controllo ha mostrato una sequenza intatta nello stesso sito. Dei sei topi elettroporati, solo quattro hanno prodotto cuccioli con mutazioni, con un'efficienza complessiva di editing del 60%. Tutte le cucciolate dei sei topi elettroporati hanno mostrato un numero ridotto di cuccioli, con solo tre o quattro cuccioli per topo.