Name: Miglioramento della tecnologia del recettore dellantigene chimerico-vescicole extracellulari (CAR-EV): il futuro della terapia del cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri il metodo di isolamento delle vescicole extracellulari CAR-EV per la terapia del cancro. Questa tecnica migliora l'efficienza dei trattamenti mirati e offre nuove possibilità per la somministrazione di terapeutici RNA.

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</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>Arricchimento EV</td></tr><tr><td>1% dodecil solfato di sodio (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771-100G</td><td>Sciogliere 1 g di polvere SDS in 10 ml di acqua ultrapura</td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata tris con Tween-20 (TBST)</td><td>Termo Chimica Scientifica</td><td>J77500. K2</td><td>Diluire con acqua ultrapura per ottenere una soluzione 1x (in alternativa, preparare una soluzione di polisorbato-20/Tween-20 allo 0,1% in 1x soluzione salina tamponata tris)</td></tr><tr><td>Micropiastra a 96 pozzetti in polistirene trasparente a fondo piatto trattato TC, sterile</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>In vitro test funzionale</td></tr><tr><td>Bolt Bis-Tris Plus Mini Gel Proteico, 4-12%, 1,0 mm, formato WedgeWell</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Caratterizzazione di celle/EV</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Codice A9647-100G</td><td>Caratterizzazione di celle/EV</td></tr><tr><td>Anticorpo Calnexina</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2433S</td><td>Caratterizzazione di celle/EV</td></tr><tr><td>Celle CAR-NK/T</td><td>ProMab Biotecnologie</td><td>Varia</td><td>Il dominio di legame del ligando extracellulare CAR dipende dal bersaglio preferito sulle cellule riceventi</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Saggio di proliferazione cellulare (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>In vitro test funzionale</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi cOmplete, Mini, senza EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Lisi cellulare</td></tr><tr><td>Reagente per la rilevazione di Western blotting ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN2232</td><td>Caratterizzazione di celle/EV</td></tr><tr><td>Tampone di eluizione</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Arricchimento/isolamento EV</td></tr><tr><td>Tampone di equilibratura</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Arricchimento/isolamento EV</td></tr><tr><td>Colonna EXO-ACE IEX</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Arricchimento/isolamento di EV per saggi funzionali a valle ID brevetto AU2024901931</td></tr><tr><td>Perle di cattura pan-esosomiale EXO-NET</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Isolamento EV per la caratterizzazione a valle ID brevetto WO/2014/011673</td></tr><tr><td>Anticorpo Granzyme B</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4275</td><td>Caratterizzazione di celle/EV</td></tr><tr><td>IL-2 Umano IS, grado premium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td>Coltura xeno-free di cellule T/NK</td></tr><tr><td>iBlot 2 pile di trasferimento, PVDF</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Caratterizzazione di celle/EV</td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF (cGMP)</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>100-0956</td><td>Coltura xeno-free di cellule T/NK</td></tr><tr><td>K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>In vitro test funzionale</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>In vitro test funzionale</td></tr><tr><td>Unità filtro siringa Millex-GP, 0,22 & micro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td>Filtrazione terminale</td></tr><tr><td>Tampone di rigenerazione</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Arricchimento/isolamento EV</td></tr><tr><td>Tampone RIPA (10X)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9806</td><td>Lisi cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Valutazione della vitalità e della densità cellulare</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Arricchimento/isolamento EV</td></tr><tr><td>Equipaggiamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore di celle automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td>Contessa II FL</td><td>Valutazione della vitalità e della densità cellulare</td></tr><tr><td>Strumento di estrazione automatizzato da banco</td><td>Invitrogen</td><td>Sistema Apex KingFisher</td><td>Sistema di purificazione automatizzato ad alta produttività Vedere il link per i dettagli del protocollo: https://www.inoviq.com/site/technology/resources</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer 7</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)</td><td>Particle Metrix GmbH</td><td>Zetaview PMX-130</td><td>Analisi delle particelle</td></tr><tr><td>Lettore di lastre</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTROstar Nano</td><td>In vitro test funzionale</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata da banco</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-15R</td><td>Colture cellulari & Elaborazione dell'arricchimento EV</td></tr><tr><td>SDS-PAGE mini serbatoio di gel</td><td>Invitrogen</td><td>Codice A25977</td><td>Caratterizzazione di celle/EV</td></tr><tr><td>Sistema di trasferimento Western blot</td><td>Invitrogen</td><td>iBlot 2</td><td>Caratterizzazione di celle/EV</td></tr></tbody></table>

miglioramento della tecnologia del recettore dell'antigene chimerico-vescicole extracellulari (car-ev): il futuro della terapia del cancro

Enhancing Chimeric Antigen Receptor-Extracellular Vesicles (CAR-EV) Technology: The Future of Cancer Therapy

Nella Figura 1 è illustrato un tipico flusso di lavoro della coltura cellulare CAR T/NK, seguito dall'isolamento, dalla caratterizzazione e dall'utilizzo delle vescicole extracellulari in un saggio funzionale. Il CM derivante dalla coltura di cellule CAR T/NK viene raccolto, prima dell'arricchimento delle EV e della caratterizzazione a valle (compresa l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle) e l'attività funzionale viene valutata tramite un saggio MTS su piastra multipozzetto (Figura 1).
Le cellule CAR marcate con GFP possono essere visualizzate al microscopio per confermare l'espressione del costrutto CAR in coltura. La microscopia deve essere eseguita come fase di routine prima e durante la raccolta del CM per garantire una sufficiente efficienza di trasduzione. È importante sovrapporre i canali del campo chiaro e della GFP per catturare la potenziale autofluorescenza quando si valuta l'efficienza. Da notare che le cellule T possiedono una tendenza ad aggregarsi naturalmente (osservata in modo simile nelle cellule NK; dati non mostrati) e la fluorescenza può essere chiaramente osservata quando le cellule mostrano un fenotipo aggregato (Figura 2).
Dopo l'arricchimento delle vescicole extracellulari, le vescicole extracellulari possono essere caratterizzate tramite NTA e immunoblotting occidentale. Utilizzando l'NTA, l'analisi della resa delle particelle può confermare un aumento della concentrazione nelle vescicole extracellulari isolate, rispetto alla CM (Figura 3A). I dati del Western blot confermano ulteriormente l'espressione del marcatore citolitico granzima B nelle cellule CAR e nelle EV, e l'assenza di calnexina in queste ultime, il che conferma l'assenza di materiale cellulare nelle preparazioni. HEK293T celle sono incluse come controllo CAR-negativo (Figura 3B).
L'analisi della funzionalità delle vescicole extracellulari è stata eseguita tramite il saggio MTS per determinare la vitalità/capacità di proliferazione cellulare. L'effetto di EGFR e CAR-EV mirati a HER2 sulla vitalità e la crescita delle cellule tumorali del sangue MCF-7 e K562 è determinato dalla misurazione del reagente colorimetrico MTS ad un'assorbanza di 490 nm (dopo la rimozione del segnale di fondo). In questo esempio, l'EGFR mirato ai CAR-EV ha ridotto la vitalità delle cellule MCF-7 e K562 rispettivamente del 70% e del 40%. L'HER-2 che prende di mira i CAR-EV ha ridotto l'MCF-7 del ~10% (come determinato tramite il t-test di Student). Considerando il layout sperimentale, l'impiego di un test non parametrico (ad esempio, Mann-Whitney U) può offrire intuizioni più solide negli studi successivi (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig1.jpg"> 
Figura 1: Generazione, arricchimento, caratterizzazione delle EV e lettura funzionale dei veicoli elettrici CAR-EV. Diagramma schematico che illustra un flusso di lavoro tipico della generazione, produzione e caratterizzazione di veicoli elettrici di campioni CAR-EV arricchiti prima dell'analisi della funzionalità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig2.jpg"> 
Figura 2: Analisi microscopica rappresentativa mediante conferma dell'espressione di GFP nelle cellule CAR-T bersaglio di HER2. Le immagini sono state acquisite tramite microscopia a fluorescenza, utilizzando un obiettivo 20x. La barra della scala bianca rappresenta una lunghezza di 50 μm. Le cellule T hanno una tendenza naturale a crescere in grumi prima del distacco in singole cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig3.jpg"> 
Figura 3: Caratterizzazione di celle CAR ed EV. (A) Analisi delle particelle di nano-tracciamento di CAR-T CM e EV arricchite. La concentrazione di particelle di EV era 1,6-2,1 volte maggiore di quella di CM, mentre la concentrazione di proteine era ridotta del &gt;80%. Le differenze statisticamente significative sono state testate con l'ANOVA unidirezionale e il test di confronto multiplo di Tukey; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) L'analisi Western blot delle cellule T trasdotte e delle CAR-EV arricchite ha confermato la presenza del granzima B citolitico sia nelle cellule CAR che nelle EV, mentre un'assenza è stata osservata in HEK293T cellule non CAR. La calnexina non è stata rilevata in CAR-EV, indicando una bassa contaminazione da particelle del reticolo endoplasmatico. Carico proteico per corsia = 5 μg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig4.jpg"> 
Figura 4: Effetto delle CAR-EV sulla vitalità delle cellule bersaglio (cellule di carcinoma mammario MCF-7 e linea cellulare di leucemia mieloide cronica K562). Le cellule bersaglio sono state trattate con una singola dose di 4,5 x 105 e 2,5 x 105 EV/cellula (EGFR o HER2 CAR, rispettivamente) o di controllo (tampone EV) per un massimo di 3 giorni. (A) Cellule CAR-EVs bersaglio per EGFR. (B) CAR-EV che hanno come bersaglio HER2. In entrambe le linee cellulari è stata osservata una diminuzione della lettura dell'assorbanza (indicativa dell'efficacia del trattamento). I dati rappresentano l'assorbanza media ± SD (n = 3), analizzata utilizzando un t-test di Student non accoppiato a due code, con valori p che indicano significatività statistica; ** pag≤ 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Miglioramento della tecnologia del recettore dell'antigene chimerico-vescicole extracellulari (CAR-EV): il futuro della terapia del cancro

CAR cell therapies have significantly advanced personalized treatment for several hematological malignancies. Currently, seven CAR-&#8239;cell products ...

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