Riprogrammazione trattabile in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche convenzionali di tipo 1

Studiamo la programmazione in vivo di cellule tumorali in cellule simili a cDC1 come nuova strategia di immunoterapia. Il nostro obiettivo è determinare se questo approccio può convertire i tumori immunitari freddi in tumori immunitari caldi, annunciando così l'immunità antitumorale. Affrontiamo i limiti delle attuali strategie di generazione di cDC1 in vivo presentando un protocollo per convertire le cellule tumorali in cellule immunogeniche simili a cDC1 direttamente all'interno del tumore, consentendo lo studio delle risposte immunitarie guidate da cDC1 in situ.

Il nostro protocollo di programmazione in vivo trattabile genera in modo affidabile cellule immunogeniche mature simili a cDC1, superando il microambiente tumorale soppressivo, e poiché queste cellule sono generate direttamente in vivo, questo approccio elimina la necessità di produrre cellule immunitarie in vitro. I nostri risultati stabiliscono una base per la traduzione in clinica della riprogrammazione mediata dal fattore di trascrizione in vivo, introducendo un'immunoterapia antitumorale pronta all'uso, ma personalizzata, che suscita risposte immunitarie antitumorali durature. Andando avanti, stiamo studiando come la riprogrammazione delle cellule cDC1-like possa suscitare la formazione di cellule terziarie e infrastrutturali e se questo si traduca in immunità umorale.

Inoltre, stiamo anche esplorando la sua potenziale sinergia con altri approcci immunoterapeutici. Per iniziare, coltiva le cellule HEK 293T fino a raggiungere il 70-80% di confluenza. Ora, agitare accuratamente la miscela di trasfezione preparata contenente il plasmide di trasferimento per un minuto e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione del complesso lipidico del DNA.

Aspirare il terreno dalle cellule HEK 293T e aggiungere 10 millilitri di DMEM senza penicillina, streptomicina e integrato con il 10% di FBS. Quindi, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia alle piastre da 150 millimetri e incubare per 16 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, sostituire il terreno con 20 millilitri di DMEM completo integrato con un millimolare di butirrato di sodio e incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Successivamente, raccogliere il surnatante contenente lentivirus in una provetta conica da 50 millilitri a 48 e 60 ore dopo la trasfezione. Dopo la prima raccolta, aggiungere 12 millilitri di DMEM completo preriscaldato per piastra da 150 millimetri per il secondo raccolto. Filtrare il liquido raccolto attraverso un filtro in polietersulfone a basso legame proteico da 0,45 micrometri.

Pipettare 37 grammi di terreno contenente lentivirus in provette di polipropilene a parete sottile aperte da 38,5 millilitri. Centrifugare le provette in un rotore a secchiello oscillante a 25.000 g per 90 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.

Posizionare i tubi di polipropilene a parete sottile aperti capovolti su una salvietta da laboratorio o materiale assorbente simile per cinque minuti per drenare il liquido in eccesso e asciugare il pellet. Successivamente, aggiungi 200 microlitri di DMEM ghiacciato integrato con HEPES o PBS a ciascun pellet e trasferisci la miscela in una provetta da microcentrifuga posta in una provetta conica da 50 millilitri. Incubare il pellet per una notte a quattro gradi Celsius per consentire la completa risospensione.

Combina tutti i pellet risospesi in un unico contenitore, aliquota il brodo virale in volumi più piccoli tra 50 e 200 microlitri e conservalo a meno 80 gradi Celsius per un uso a lungo termine. Dopo l'espansione delle cellule tumorali, preparare le sospensioni cellulari per la trasduzione per ottenere un rapporto quasi uno a uno tra cellule EGFP positive e EGFP negative il terzo giorno. Aggiungere otto microgrammi per millilitro di polibrene alla sospensione cellulare, seguiti dal volume appropriato di lentivirus, come precedentemente determinato.

Mescolare delicatamente il contenuto senza generare bolle. Ora, pipettare due millilitri della sospensione cellulare preparata contenente una volta 10 alla potenza di cinque cellule in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno contenente lentivirus da ciascun pozzetto.

Lavare i pozzetti due volte con PBS. Aggiungere 500 microlitri di tripsina in ogni pozzetto e incubare per 5-10 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, esaminare i pozzetti al microscopio ottico per confermare il completo distacco delle cellule dalla piastra.

Quindi, raccogliere le cellule utilizzando un terreno completo in provette coniche da 50 millilitri. Centrifugare le celle per cinque minuti a 350 g per pellettarle. Lavare il pellet con PBS.

Prelevare un'aliquota e valutare la conta delle cellule vitali utilizzando un emocitometro e la colorazione con blu di tripano. Successivamente, risospendere il pellet di cella finale in PBS ghiacciato per ottenere una concentrazione da due a quattro volte 10 alla potenza di sette cellule per millilitro, corrispondente a una o due volte 10 alla potenza di sei cellule in 50 microlitri per tumore. Posiziona le celle sul ghiaccio e trasferiscile nell'area dell'esperimento sugli animali.

Dopo aver anestetizzato il mouse CD45.1, posizionarlo su un tappetino riscaldante per prevenire l'ipotermia. Applicare la crema per gli occhi sul topo per prevenire la disidratazione oculare durante l'anestesia. Usando un rasoio, radere il fianco destro del topo.

Facoltativamente, contrassegnare il mouse con un tagliaorecchie. Disinfettare l'area rasata e rimuovere i peli rimanenti con un tampone imbevuto di etanolo al 70%. Ora, utilizzando una pipetta P1000, risospendere accuratamente le cellule tumorali.

Caricare la sospensione cellulare completamente risoluta in una siringa da 0,5 millilitri dotata di un ago calibro 30. Sollevare delicatamente la pelle sul fianco rasato del topo con due dita e inserire la punta dell'ago della siringa nella piega formata dalla pelle sollevata. Rilasciare la pelle sollevata tenendo la siringa in posizione con una mano.

Usa l'altra mano per allungare la parte superiore della pelle con due dita. Iniettare lentamente 50 microlitri della sospensione di cellule tumorali per creare un rigonfiamento sottocutaneo visibile di forma ovale nel sito di iniezione. Dopo la procedura di iniezione, monitorare l'animale fino a quando non si risveglia completamente dall'anestesia per garantire la sopravvivenza.

Le cellule HEK 293T trasfettate con il plasmide SFFV-PIB-eGFP hanno mostrato una chiara espressione di eGFP 24 ore dopo la trasfezione, confermando il successo della somministrazione plasmatica. 72 ore dopo la trasduzione, le cellule di melanoma hanno indicato il successo della somministrazione dei fattori di riprogrammazione e dell'eGFP. Il nono giorno dopo l'impianto delle cellule, la riprogrammazione in vivo ha prodotto una percentuale più elevata di cellule CD45-positive, MHC-II-positive e cDC1-like completamente riprogrammate rispetto alle condizioni in vitro.

Il terzo giorno dopo l'impianto, i tumori PIB-eGFP hanno mostrato un'infiltrazione di cellule immunitarie CD45-positive marcatamente più elevata rispetto ai controlli eGFP, indicando un precoce rimodellamento immunitario. Al nono giorno, l'intensità media della fluorescenza di CD45 per area tumorale è rimasta significativamente più alta nei tumori PIB-eGFP rispetto ai controlli. Le strutture linfoidi terziarie sono diventate rilevabili nei tumori PIB-eGFP entro il nono giorno, indicando cambiamenti immunitari strutturali nel microambiente tumorale.