Name: Riprogrammazione trattabile in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche convenzionali di tipo 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Scopri la riprogrammazione in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche cDC1-like mediante i fattori di trascrizione PU.1, IRF8 e BATF3. Questo metodo innovativo trasforma tumori freddi in caldi, potenziando l'immunità antitumorale.

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<ol><li>Oliveira, G., Wu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+specificities+of+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).</li>
<li>Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-year+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).</li>
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<li>Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+trial+of+trifluridine%2Ftipiracil+plus+nivolumab+in+patients+with+heavily+pretreated+microsatellite-stable+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).</li>
<li>Reardon, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+phase+3+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+nivolumab+vs+bevacizumab+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%3A+CheckMate+143%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143.</a> Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+as+orchestrators+of+anticancer+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).</li>
<li>Heras-Murillo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+with+conventional+type-1+dendritic+cells+induces+immune+memory+and+limits+tumor+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse.</a> Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).</li>
<li>Theisen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WDFY4+is+required+for+cross-presentation+in+response+to+viral+and+tumor+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens.</a> Science. 362 (6415), 694-699 (2018).</li>
<li>Meiser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+stimulatory+cDC1+subpopulation+amplifies+CD8%2B+T+cell+responses+in+tumors+for+protective+anti-cancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity.</a> Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).</li>
<li>Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-residing+Batf3+dendritic+cells+are+required+for+effector+T+cell+trafficking+and+adoptive+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy.</a> Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).</li>
<li>Hubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-III+is+selectively+produced+by+cDC1+and+predicts+good+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer.</a> Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).</li>
<li>Mahadevan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+conventional+dendritic+cells+facilitate+immunotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer.</a> Science. 384 (6703), eadh4567(2024).</li>
<li>Ascic, E., Pereira, C. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).</li>
<li>Silk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+tumour+antigens+by+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+CD141%2B+XCR1%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells.</a> Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).</li>
<li>Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+generation+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and generation of human dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).</li>
<li>Makino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cDC-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).</li>
<li>Balan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+human+dendritic+cell+differentiation+revealing+Notch-dependent+lineage+bifurcation+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity.</a> Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).</li>
<li>Ascic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+cell+reprogramming+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy.</a> Science. 386 (6719), eadn9083(2024).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+antigen-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+informs+efficient+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+cross-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).</li>
<li>Zimmermannova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+tumor+immunogenicity+with+dendritic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming.</a> Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).</li>
<li>Bouquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RapaCaspase-9-based+suicide+gene+applied+to+the+safety+of+IL-1RAP+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells.</a> Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+primary+human+fibroblasts+with+only+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).</li>
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<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).</li>
<li>Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cancer+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells.</a> Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).</li>
<li>Cabrita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+lymphoid+structures+improve+immunotherapy+and+survival+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma.</a> Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).</li>
<li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+endogenous+retroviruses+promote+lung+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy.</a> Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m filtro legante a basso contenuto proteico, filtro sottovuoto per bottiglie da 150 mL</td><td>Fisher scientifico</td><td>15983297</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale CD45 anti-topo (clone: 30-F11), IgG2b di ratto, &kappa;</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>14-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)</td><td>Il laboratorio Jackson</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da insulina BD Micro-Fine U-100 (0,5 mL)</td><td>Fisher Scientifico</td><td>11395751</td><td></td></tr><tr><td>Topi C57BL/6J</td><td>Il laboratorio Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare Corning Falcon per l'uso con tubi conici da 50 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS352340</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura Corning 24 x 50 mm&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Colorante di vitalità fissabile eFluor 450</td><td>Invitrogen</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Soluzione per il recupero dell'antigene IHC - pH basso (10x)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>00-4955-58</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Fluoromount-G</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GFP [Alexa Fluor 594]</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-308AF594</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM/Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (100x)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medio</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Piruvato di Sodio (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypan Blue Soluzione, 0,4%</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Integratore GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario crossadsorbito IgG (H+L) anti-ratto di capra, policlonale, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>Celle HEK 293T</td><td>ATTC</td><td>Codice CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di esadimetrina (Polybrene)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio</td><td>Citiva</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillina Streptomicina 100x Soluzione (Pen/Strepto)</td><td>Citiva</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato HyClone (PBS)</td><td>Citiva</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminolo veterinario. Soluzione iniettabile 100 mg/mL</td><td>MSD Salute animale Svezia</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>Lama per microtomo - C35</td><td>PFM Medicale</td><td>207500005</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-CD45.2 (104), Superficie, APC, Monoclonale</td><td>Bioleggenda</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-MHCII (M5/114.15.2), Superficie, PE-Cy7, Monoclonale</td><td>Bioleggenda</td><td>107630</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Siero di ratto normale (sterile)</td><td>Abcam</td><td>ab7488</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in polipropilene a parete sottile open-top</td><td>Beckman Coulter Scienze della vita</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, 16% p/v aq. soln., senza metanolo</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>043368.9M</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Batf3, un mouse monocistronico che codifica cassette Batf3</td><td>Addgene</td><td>139837</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Irf8, un mouse monocistronico per la codifica a cassette Irf8</td><td>Addgene</td><td>139838</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Pu.1, un mouse monocistronico per la codifica a cassetta Pu.1</td><td>Addgene</td><td>139839</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide SFFV-eGFP (eGFP)</td><td>Clonazione interna</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide SFFV-mCherry (mCherry)</td><td>Clonazione interna</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide SFFV-PIB-eGFP,&nbsp; un mouse che codifica per cassette policistroniche PU.1, IRF8 e BATF3 (PIB)&nbsp;</td><td>Clonazione interna</td><td>-</td><td>I costrutti e i vettori utilizzati per la riprogrammazione sono disponibili presso Asgard Therapeutics nell'ambito di un accordo di trasferimento di materiale con l'azienda</td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI), lineare, MW 25000, grado di trasfezione</td><td>Poliscienze</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>ReadyProbes Penna per Pap con barriera idrofobica</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>R3777</td><td></td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio ad adesione SuperFrost Plus</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzima (1x) senza rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>TT Cryomold Intermedio, quadrato (15 x 15 x 5 mm)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Veterinario di Xysol. Soluzione iniettabile 20 mg/mL</td><td>VM Pharma</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr><tr><td>Celle YUMM1.7</td><td>Antineo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

riprogrammazione trattabile in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche convenzionali di tipo 1

Tractable In Vivo Reprogramming of Tumor Cells to Type 1 Conventional Dendritic Cell-like Cells

Una panoramica schematica del protocollo di riprogrammazione in vivo trattabile è presentata nella Figura 1. In primo luogo, abbiamo prodotto il vettore lentivirale policistronico SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), che codifica per i fattori di riprogrammazione PU.1, IRF8, BATF3 che istruiscono cDC1, seguito da un sito di ingresso ribosomiale interno (IRES) e da una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) nella linea cellulare di confezionamento HEK 293T. Per controllare l'immunogenicità mediata da lentivirus, abbiamo prodotto un vettore SFFV-MCS-eGFP (eGFP) vuoto, contenente un sito di clonazione multipla (MCS) e IRES-eGFP, ma escludendo i fattori di riprogrammazione. Dopo la produzione virale, abbiamo raccolto il surnatante contenente lentivirus e lo abbiamo concentrato mediante ultracentrifugazione. Abbiamo titolato funzionalmente il virus per determinare la quantità necessaria per ottenere un rapporto 1:1 tra cellule trasdotte (eGFP+) e non trasdotte (eGFP-), che abbiamo valutato il giorno 3 dopo la trasduzione. Quindi, abbiamo utilizzato la quantità di virus risultante per trasdurre la linea cellulare tumorale selezionata il giorno -1. Dopo 24 ore, abbiamo raccolto le cellule e le abbiamo impiantate per via sottocutanea per stabilire i tumori. Questa strategia ha garantito che le cellule trasdotte si riprogrammassero in cellule simili a cDC1 in vivo, all'interno del TME. Nei momenti indicati dopo l'attecchimento, abbiamo asportato e processato i tumori per le analisi a valle, tra cui la citometria a flusso di cellule tumorali dissociate, per quantificare l'efficienza della riprogrammazione in vivo , o la colorazione in immunofluorescenza di sezioni tumorali crioconservate per caratterizzare i cambiamenti nel TME.
In primo luogo, per garantire la produzione di titoli lentivirali elevati, abbiamo monitorato le cellule HEK 293T prima della trasfezione, con l'obiettivo di raggiungere il 70-80% di confluenza e 24 ore dopo, abbiamo valutato l'efficienza della trasfezione attraverso l'espressione di eGFP mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2A). Successivamente, abbiamo raccolto il terreno contenente il virus 48 ore e 60 ore dopo la trasfezione, lo abbiamo ultracentrifugato e conservato in aliquote a -80 °C (Figura 2B). Quindi, abbiamo determinato la quantità virale ottimale necessaria per ottenere un rapporto 1:1 tra cellule eGFP+ ed eGFP- nelle cellule di melanoma YUMM1.7. Abbiamo seminato 10cellule da 5 YUMM1.7 per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti, abbiamo trasdotto le cellule con volumi crescenti di lentivirus e sostituito il surnatante contenente il virus con un terreno completo DMEM/F12 fresco dopo 24 ore (Figura 2C). Il giorno 3, abbiamo valutato l'espressione di eGFP mediante microscopia a fluorescenza, prima di procedere alla quantificazione delle percentuali precise di cellule eGFP+ mediante citometria a flusso (Figura 2C). Per quantificare il rapporto tra cellule eGFP+ ed eGFP- , abbiamo effettuato un gating in singole cellule vive per escludere cellule morte e doppietti (Figura 2D). Il volume ottimale del lotto di lentivirus prodotto è stato determinato sia per PIB-eGFP che per il virus eGFP di controllo come 2 μL per 10cellule 5 YUMM1.7, risultando rispettivamente in 50,0 ± 0,3% e 63,0 ± 0,9% di cellule eGFP+ (Figura 2E).
Successivamente, per valutare l'efficienza della riprogrammazione in vivo, abbiamo generato una linea cellulare tumorale marcata in fluorescenza (mCherry+) (YUMM1.7-mCherry). Ciò ha garantito la possibilità di discriminare tra cellule tumorali e cellule stromali o immunitarie mediante gating in cellule vive di mCherry+ nell'analisi di citometria a flusso (Figura 3A, B). Abbiamo quindi trasdotto le cellule YUMM1.7-mCherry con 2 μL di PIB-eGFP o virus eGFP di controllo per 105 cellule per ottenere un rapporto eGFP+ / eGFP- di 1:1. Abbiamo impiantato per via sottocutanea 1,6 × 10cellule per tumore in topi CD45.1 e abbiamo conservato un'aliquota di cellule in coltura in vitro per il confronto. Abbiamo valutato l'efficienza della riprogrammazione mediante citometria a flusso, gating di cellule vive mCherry+, eGFP+ e CD45.1- per escludere le cellule immunitarie dell'ospite che hanno inghiottito eGFP o mCherry (Figura 3B). Dal giorno 1 al giorno 9, abbiamo osservato l'acquisizione graduale dell'espressione di CD45.2 e/o MHC-II, marcando cellule cDC1-like parzialmente riprogrammate (CD45.2+ MHC-II- o CD45.2- MHC-II+) e cellule cDC1-like completamente riprogrammate (CD45+ MHC-II+) (Figura 3C). Abbiamo convalidato che la riprogrammazione delle cellule tumorali di topo in vivo ha portato a percentuali più elevate di cellule cDC1-like al giorno 9 rispetto alle condizioni in vitro (9,54 ± 1,54% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 4,72 ± 1,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,018). Anche la cinetica di riprogrammazione è stata accelerata poiché abbiamo osservato una percentuale più elevata di cellule cDC1-like già al giorno 4 (8,7 ± 3,3% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 0,3 ± 0,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,05), indicando che la presenza di segnali ambientali promuove una riprogrammazione più rapida ed efficiente verso le cellule cDC1-like19. Mentre le cellule cDC1-like riprogrammate in vitro erano presenti fino al giorno 15, le cellule cDC1-like in vivo persistevano per 9 giorni, ma non venivano rilevate entro il giorno 15, suggerendo la deplezione del TME da parte del sistema immunitario dell'ospite (Figura 3C). 
Infine, abbiamo mirato a caratterizzare le prime variazioni del TME a seguito della riprogrammazione in vivo di cDC1 nei primi 9 giorni. Abbiamo eseguito la colorazione in immunofluorescenza di tessuti tumorali crioconservati e sezionati da tumori eGFP e PIB-eGFP dopo 3 e 9 giorni di riprogrammazione in vivo , concentrandoci sull'infiltrazione di cellule immunitarie marcate dal marcatore pan-ematopoietico CD45. In particolare, le cellule cDC1-like hanno reclutato un numero significativamente maggiore di cellule CD45 nel TME il giorno 3, rispetto ai tumori eGFP (49,6 ± 17,0 vs. 8,0 ± 5,8 eGFP intensità media di fluorescenza della colorazione CD45 per area tumorale; Figura 4A, B). È interessante notare che abbiamo rilevato TLS all'interno del TME dei tumori dopo 9 giorni di riprogrammazione in vivo . Ciò suggerisce che le cellule simili a cDC1 possono rimodellare rapidamente il TME da un ambiente "immuno-freddo" a uno "immuno-caldo" entro 3 giorni, il che porta successivamente alla formazione di TLS il giorno 9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig1.jpg"> 
Figura 1: Panoramica del protocollo per generare cellule simili a cDC1 mediante riprogrammazione in vivo di cellule tumorali. I vettori lentivirali SFFV-PIB-IRES-eGFP che codifica PU.1, IRF8 e BATF3 in una cassetta policistronica sotto il controllo del promotore del virus che forma il fuoco della milza (SFFV) e l'eGFP dopo un sito di ingresso del ribosoma interno (IRES) per tracciare le cellule trasdotte mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza - sono prodotti nella linea cellulare di confezionamento HEK 293T. Quindi, i vettori lentivirali vengono ultracentrifugati e titolati funzionalmente per determinare la quantità di virus necessaria per la trasduzione delle cellule tumorali in un rapporto di 1:1 tra eGFP+ trasdotta e cellule eGFP- non trasdotte. Per gli esperimenti di riprogrammazione in vivo , le cellule tumorali vengono piastrate con la quantità ottimale di lentivirus il giorno -1. Il giorno successivo, questa miscela 1:1 di cellule GFP+ trasdotte e GFP- non trasdotte viene lavata e raccolta per l'insediamento del tumore sottocutaneo nei topi. Le colture in vitro parallele vengono mantenute per convalidare la trasduzione il giorno 3 mediante citometria a flusso. Gli animali vengono monitorati ogni 2-3 giorni per la crescita e la sopravvivenza del tumore. I tumori vengono raccolti in punti temporali definiti, dissociati e colorati per l'espressione di marcatori di superficie per l'analisi della citometria a flusso. In alternativa, i tessuti interi vengono fissati, crioconservati e sezionati per la colorazione in immunofluorescenza e l'analisi al microscopio confocale. L'efficienza della riprogrammazione in vivo è valutata mediante analisi di citometria a flusso, mentre le variazioni nel microambiente tumorale sono caratterizzate dall'imaging confocale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig2.jpg"> 
Figura 2: Produzione e titolazione funzionale del lentivirus per la riprogrammazione in vivo di cDC1. (A) Quando le cellule HEK 293T raggiungono una confluenza del ~70-80%, vengono trasfettate con una miscela contenente 10 μg di plasmide di trasferimento SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) o di controllo del vettore lentivirale vuoto SFFV-eGFP (eGFP), insieme a 7,5 μg di psPAX2 e 2,5 μg di mPD2.G e 60 μL di 1 mg/mL di PEI. Immagini al microscopio in campo chiaro e a fluorescenza di cellule HEK 293T che mostrano l'espressione di eGFP 24 ore dopo la trasfezione, indicando il successo della somministrazione del plasmide. Barre di scala = 200 μm. (B) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro dell'ultracentrifugazione per concentrare il lentivirus. Il surnatante contenente lentivirus delle cellule HEK 293T viene raccolto 48 ore e 60 ore dopo la trasfezione, filtrato attraverso un filtro PES a basso legame proteico da 0,45 μm e pesato 37 g in provette di polipropilene a parete sottile Open-Top utilizzando una bilancia da banco. Le provette vengono ultracentrifugate in un rotore a secchiello oscillante, il surnatante viene aspirato e il pellet essiccato per 5 minuti. I pellet vengono quindi risospesi in DMEM ghiacciato contenente HEPES e incubati per una notte prima di aliquotare e conservare a -80 °C. (C) Strategia sperimentale della titolazione funzionale per determinare la dose virale ottimale per ottenere un rapporto 1:1 tra cellule GFP+ e GFP-. Immagini al microscopio in campo chiaro e a fluorescenza che mostrano l'espressione di eGFP nelle cellule di melanoma YUMM1.7, 72 ore dopo la trasduzione, indicando il successo della somministrazione dei fattori di riprogrammazione e dell'eGFP. Barre della scala = 100 μm. (D) Grafici rappresentativi della citometria a flusso che mostrano la strategia di gating per quantificare il rapporto tra le cellule eGFP+ . Le cellule vive sono state sottoposte a gated per la popolazione negativa al colorante di vitalità (DAPI) seguita dall'esclusione del doppietto. (E) Quantificazione in citometria a flusso dell'efficienza di trasduzione con l'aumento delle dosi virali per determinare il volume ottimale per ottenere cellule GFP+/GFP- 1:1. Sia per PIB-eGFP che per eGFP lentivirus, 2 μL di volume per 105 cellule hanno raggiunto il rapporto desiderato. Abbreviazioni: cDC1s = cellule dendritiche convenzionali di tipo 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; PEI = polietilenimmina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig3.jpg"> 
Figura 3: Valutazione dell'efficienza di riprogrammazione in vivo di cDC1. (A) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale per la valutazione dell'efficienza di riprogrammazione in vivo di cDC1. Le cellule tumorali vengono inizialmente trasdotte con un lentivirus che esprime mCherry per generare una linea cellulare marcata in fluorescenza (YUMM1.7-mCherry), seguita dalla trasduzione con la dose ottimizzata di lentivirus PIB-eGFP il giorno -1. Le cellule vengono quindi iniettate per via sottocutanea con un rapporto 1:1 di cellule eGFP+/eGFP- il giorno 0 per stabilire i tumori nei topi CD45.1 e consentire alle cellule trasdotte da PIB di riprogrammarsi in cellule simili a cDC1 all'interno del TME. I tumori vengono quindi isolati nei punti temporali indicati, dissociati e colorati per CD45.1, CD45.2 e MHC-II utilizzando la citometria a flusso. Ciò consente l'esclusione delle cellule immunitarie dell'ospite CD45.1 per quantificare in vivo l'efficienza di riprogrammazione di cDC1 attraverso l'espressione di CD45.2 e MHC-II. Le colture in vitro parallele vengono conservate per tutti i punti temporali come confronto con la riprogrammazione in vivo. (B) Grafici rappresentativi della citometria a flusso che illustrano la strategia di gating il giorno 9. Le cellule sono state gated su mCherry+ e GFP+ per identificare le cellule tumorali trasdotte con successo. Le cellule immunitarie dell'ospite sono state escluse mediante gating out delle cellule CD45.1+. (C) Quantificazione dell'efficienza di riprogrammazione in vivo (a sinistra) di cellule YUMM1.7-mCherry mediante citometria a flusso come percentuale di cellule CD45+ MHC-II+ (completamente riprogrammate) e CD45.2+ HLA-DR- o CD45.2-HLA-DR+ cDC1-like (parzialmente riprogrammate) gated all'interno di eGFP+ mCherry+ cellule. Grafici rappresentativi della citometria a flusso (a destra) che mostrano l'acquisizione graduale dell'espressione di CD45.2 e MHC-II nelle cellule YUMM1.7-mCherry trasdotte da PIB-eGFP durante i punti temporali indicati. Le cellule YUMM1.7-mCherry trasdotte con eGFP sono state utilizzate come controllo e le cellule cDC1-like riprogrammate in vitro sono state utilizzate per il confronto. I dati in (C) indicano ± SD medio di 3-5 esperimenti di replicazione biologica. L'analisi statistica in (C) è stata eseguita per le cellule CD45+ MHC-II+ utilizzando il test di Mann-Whitney. *P &lt; 0,05. Abbreviazioni: cDC1s = cellule dendritiche convenzionali di tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; TME = microambiente tumorale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig4.jpg"> 
Figura 4: Analisi dell'infiltrazione immunitaria nel microambiente tumorale a seguito della riprogrammazione in vivo di cDC1. (A) Immagini confocali rappresentative che mostrino le cellule CD45+ nei tumori YUMM1.7 dopo l'impianto sottocutaneo di cellule trasdotte PIB-eGFP- o di controllo eGFP (rapporto 1:1 tra cellule trasdotte e cellule parentali) nei giorni 3 e 9. Barre della scala = 500 μm. (B) Quantificazione dell'MFI per la colorazione con CD45 in tumori YUMM1.7 trattati con PIB e di controllo trasdotti con eGFP nei giorni 3 e 9. I dati in (B) indicano ± SD medio di 3-6 esperimenti di replicazione biologica. L'analisi statistica in (B) è stata eseguita utilizzando il test di Mann-Whitney. *P &lt; 0,05 e ***P &lt; 0,001. Abbreviazioni: cDC1s = cellule dendritiche convenzionali di tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; MFI = intensità media della fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Riprogrammazione trattabile in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche convenzionali di tipo 1

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