SCAnED - Una macro di segmentazione cutanea open-source per il rilevamento semi-automatico di cellule e nuclei nei compartimenti cutanei epidermici e dermici

Nel nostro lavoro, indaghiamo i meccanismi regolatori che mantengono l'omeostasi tissutale a livello molecolare, cellulare, strutturale e meccanico. Il nostro obiettivo è comprendere condizioni patologiche, come l'infiammazione della pelle o il cancro. Con nuovi strumenti di imaging ad alta risoluzione e multiomica, ora possiamo mappare i cambiamenti di espressione cellulare e genica nei tessuti sia in 2D che in 3D.

Questo sta davvero stimolando la nostra comprensione di come si sviluppano e progredissero le malattie. Una delle grandi sfide attuali è la grande quantità di dati generati dalla microscopia avanzata. E sebbene esistano più strumenti disponibili per analizzare le immagini, spesso non sono facili da usare per chi non ha molta esperienza, o sono piuttosto costosi.

Il nostro protocollo offre uno strumento gratuito e facile da usare per analizzare le cellule della pelle umana sia nella pelle che nel derme. Migliora la precisione rispetto agli strumenti generali e non richiede esperienza di programmazione o analisi delle immagini. Per cominciare, apri le immagini di immunofluorescenza in Fiji o Immagine J, usando i formati bio con le impostazioni predefinite.

Non separare i canali durante questo passaggio. Scarica la macro SCAnED ed ed eseguila selezionando i plugin. Poi macro e clicca su esegui.

Seleziona il file script macro SCAnED quando richiesto. Segui le istruzioni a schermo fornite dalla macro. Seleziona il canale E-cadherin quando la macro lo richieste.

Successivamente, naviga fino all'immagine, scegli aggiusta, poi soglia per regolare manualmente la soglia per il canale E-cadherin. Clicca OK una volta che la regione epidermica è completamente catturata. Poi seleziona il canale DAP-E quando viene richiesto di procedere con la segmentazione.

Definisci automaticamente i livelli di intensità per la segmentazione dei nuclei quando si utilizza la funzione soglia. Per StarDist, apri il plugin nell'Immagine J. Carica il modello di rilevamento dei nuclei nell'interfaccia grafica di StarDist e clicca sul canale dei nuclei per selezionarlo per l'analisi. Ora, regola le impostazioni delle tile in StarDist per corrispondere alla dimensione prevista della patch di 256 per 256 pixel.

Quando richiesto, seleziona sì per misurare l'intensità del marcatore all'interno dei nuclei. Poi ripete il processo di segmentazione e analisi per ogni canale di fluorescenza. Dopo che tutti i canali sono stati elaborati, salva i dati di output come file di valori separati da virgola come indicato dalla macro.

Per la regione citoplasmatica, quando la segmentazione dei nuclei è stata eseguita utilizzando la funzione soglia, si applica la dilatazione binaria per espandere la regione nucleare di interesse. Quando StarDist è stato utilizzato per la segmentazione dei nuclei, applicare l'espansione di ingrandimento alla regione nucleare di interesse. Seleziona sì quando viene richiesto per misurare l'intensità del marcatore all'interno dell'intera area cellulare.

Successivamente salva i file di dati risultanti come formato di valori separati da virgola secondo le istruzioni macro. Stabilire soglie di intensità specifiche per il marcatore utilizzando campioni di controllo isotipi. Scarica il quaderno Jupyter appropriato e naviga su Google Collab per selezionare il file, seguito da quaderno aperto.

Scegli il file ed esegui le celle di codice in sequenza. Quando viene richiesto con l'opzione scegli file, clicca sul pulsante e carica il file di valori separati da virgola. Per ogni anticorpo, calcola l'intensità media della fluorescenza utilizzando i file di controllo isotype.

Per determinare le soglie di soglia di soglia di soffia, apri il taccuino del dot plot, carica i dati di controllo dell'isotipo ed esegui il codice. Basandosi sulla distribuzione dei punti nei grafici sia per il controllo isotipo sia per i dati specifici di anticorpi, si seleziona una soglia di intensità per distinguere il segnale di fondo dall'espressione vera del marcatore. Usa questa soglia per classificare ogni cella come positiva o negativa per il marcatore dato.

Infine, crea diagrammi di punti per visualizzare i pattern di co-espressione dei marcatori eseguendo il codice del grafico di punti nel quaderno Google Collaborab. Nelle immagini segmentate manualmente, le cellule positive alla vimentina hanno mostrato un forte segnale citoplasmatico con chiari limiti di ROI che coprono l'intero corpo cellulare. La segmentazione semi-automatizzata SCAnED ha catturato celle positive alla vimentina con confini simili utilizzando un approccio a soglia e dilatazione.

Il confronto quantitativo dell'intensità della vimentina in 21 cellule non ha mostrato differenze significative tra segmentazione manuale e SCAnED. L'analisi istografica ha rivelato una frequenza più elevata di cellule positive alla vimentina nel derme della psoriasi rispetto a quelle della pelle sana. L'analisi del dot plot delle cellule dermiche ha mostrato un aumento delle cellule positive a vitamina CD-90 positiva alla vimentina nella psoriasi rispetto a quelle di pelle sana.

Nell'epidermide, i campioni di psoriasi hanno mostrato un aumento delle cellule negative-vimentina a CD-90, possibilmente cheratinociti, rispetto alla pelle sana. I conteggi cellulari positivi per la vimentina nella psoriatica e nell'epidermide sana erano comparabili tra SCAnED e QuPath. la segmentazione visiva ha mostrato che SCAnED ha assegnato cellule di confine all'epidermide con maggiore precisione rispetto a QuPath, che ne ha assegnate erroneamente diverse.