Rapida ottimizzazione di un sistema inducibile dalla luce per controllare l'espressione genica nei mammiferi

Questo progetto mira a sviluppare un metodo ad alto rendimento per ottimizzare e caratterizzare uno strumento optogenetico multicomponente chiamato LACE per l'espressione genica nei mammiferi. Per cominciare, posizionare una fiaschetta di coltura cellulare contenente cellule T HEK 293 all'interno di un armadietto di biosicurezza. Usa una pipetta sierologica per aspirare il substrato esaurito.

Pipetta 10 millilitri di DPBS in un angolo della fiaschetta e fai ruotare delicatamente per lavare le celle. Poi aspira la soluzione di lavaggio e getta sia il DPBS che l'aspiratore nel contenitore dei rifiuti. Ora aggiungi 1,5 millilitri di 0,05% di tripsina-EDTA alla fiaschetta per coprire la superficie e incubare.

Tocca delicatamente la fiaschetta per allentare le cellule dalla superficie. Successivamente, pipetta 8,5 millilitri di DMEM fresco nella fiaschetta. Aspirare la soluzione su e giù finché non sono visibili aggregati per risospendere le cellule.

Poi trasferisci nove millilitri della sospensione della cella in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungi nove millilitri di DMEM fresco alla fiaschetta. Incubare la sospensione fino a una confluenza sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.

Ora, mescola 10 microlitri delle cellule sospese con 10 microlitri di colorante tripsinico in un rapporto uno a uno per calcolare la concentrazione cellulare usando un emocitometro. Semina circa 35.000 celle in 100 microlitri in ciascun pozzo di una piastra nera, ad alta prestazione, numero 1,5, con fondo di vetro, a 96 pozzi. Inserire il piatto in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Per la trasfezione, prima si mettono 11 microlitri di DMEM caldo senza siero in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri per un pozzo e un eccesso del 10%. Preparare vari rapporti di massa plasmidicale della proteina fluorescente verde potenziata da CRY2 a RNA/Aliquota guida CIBN/110 nanogrammi per pozzetto delle soluzioni preparate in ogni tubo contenente le aliquote del mezzo senza siero. Poi pipetta ulteriori 11 microlitri di DMEM senza siero per ogni pozzo in tubetti separati per la diluizione del reagente di trasfezione.

Aggiungere il reagente di trasfezione diluito alla miscela di DNA e incubare per formare i complessi di trasfezione. Successivamente pipetta 20 microlitri del complesso di trasfezione preparato in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzi contenente le cellule T HEK 293. Avvolgi la piastra a 96 pozzi in carta stagnola di alluminio e mettila in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Per iniziare il processo di attivazione, si modifica il codice di input del microcontrollore per illuminare i pozzi desiderati utilizzando le linee di script specificate. Imposta l'intensità del diodo emettente luminoso a 9,27 milliwatt per centimetro quadrato utilizzando le linee di codice indicate. Regola la durata dell'impulso a un secondo, poi imposta la frequenza dell'impulso a 0,067 hertz, equivalente a ogni 15 secondi.

Spruzza il coperchio stampato in 3D dell'optoPlate con etanolo al 70%. Poi lascialo asciugare in un armadietto di biosicurezza. Ora, accendi una lampada rossa nella camera oscura.

Metti la piastra a 96 pozzi nell'armadietto di biosicurezza. Sostituisci il coperchio del piatto con quello asciutto stampato in 3D. Posizionare la piastra a 96 pozzi sulla matrice LED per assemblare l'apparato di attivazione.

Inserire l'apparato completamente assemblato a LED array in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Collega il microcontrollore, il diodo emettente di luce e le porte della ventola a una fonte di alimentazione. Per eseguire la citometria a flusso, esegui il programma di avvio del sistema sul software esperto del sito.

Carica due millilitri di acqua deionizzata nel caricatore di campioni. Esegui il controllo qualità utilizzando le perline di controllo qualità fornite. Configurare e specificare i pozzi campione da acquisire.

Crea i grafici e le tabelle per la dispersione laterale rispetto alla diffusione diretta, l'altezza della dispersione laterale rispetto all'area di dispersione laterale, l'area di dispersione laterale rispetto al FITC-A e la tabella statistica FITC-A. Ora, inserisci la piastra a V a 960 pozzi nel caricatore di placche del citometro. Seleziona un pozzo non trasfettato e clicca su Inizializza, seguito da Esegui.

Regolare la diffusione laterale e le tensioni FITC per centrare la popolazione di interesse sul grafico SSC-A rispetto a FSC-A. Clicca su Esegui, poi seleziona una proteina fluorescente verde ben trasfettata con CMV. Regolare la tensione FITC per includere sia celle autofluorescenti che celle fluorescenti nel grafico SSC-A rispetto a FITC-A.

Crea un poligono per bloccare la popolazione cellulare sana. Un secondo poligono per la barriera per la discriminazione dei doppietti nel grafico SSC-H contro SSC-A. Crea un gate poligonale per distinguere le cellule fluorescenti da quelle non fluorescenti usando il gate dalle celle non trasfettate come riferimento.

Registrazione automatica dei campioni a 60 microlitri al minuto fino a quando non sono trascorsi 200 secondi o fino a quando non sono stati raggiunti 10.000 eventi. Poi esporta i valori medi FITC come file CSV e analizza i dati. Pulisci il citometro di flusso selezionando l'opzione di pulizia giornaliera.

L'imaging a fluorescenza ha mostrato che a un rapporto di massa di uno a nove la luce blu l'attivazione induceva un'espressione massima di eGFP inferiore rispetto al rapporto cinque a cinque, che mostrava anch'esso una maggiore perdita in condizioni di buio. La citometria a flusso ha mostrato che oltre il 95% degli eventi a porta in P1 erano singoletti in tutte le condizioni. E le cellule non trasfettate avevano una popolazione meno dello 0,1% positiva a eGFP.

Il controllo CMV-eGFP aveva circa il 99% di cellule positive a eGFP, mentre quelle trasfettate con 2pLACE circa il 57%. Le cellule trasfettate con CMV-eGFP hanno mostrato una forte espressione costitutiva di eGFP sia in condizioni di luce che di scuro, mentre le cellule non trasfettate non hanno mostrato fluorescenza visibile. Ha inoltre confermato il successo della trasfezione di 2pLACE e l'attivazione dell'espressione di eGFP sotto luce blu con un'espressione inferiore rispetto a CMVeGFP. Un aumento triplo dell'espressione di eGFP è stato osservato nei campioni di 2pLACE attivati dalla luce rispetto alle condizioni buie.

La percentuale di cellule positive a eGFP nei campioni trasfectati con 2pLACE era di circa il 60%. Il rapporto di massa da tre a sette ha prodotto la massima intensità media di fluorescenza e gamma dinamica. Questo protocollo consente la valutazione ad alta velocità di campioni e la replica tecnica utilizzando l'optoPlate per programmare condizioni di luce e frequenze di impulsi variabili.