Name: Perfezionamento della produzione di ribosomi grezzi e PURE di OnePot per una sintesi proteica riproducibile senza cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri il protocollo perfezionato OnePOT PURE e la preparazione di ribosomi grezzi per migliorare la riproducibilità nella sintesi proteica senza cellule. Standardizzazione del controllo della crescita e della glicerolo per risultati consistenti.

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<ol><li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pure+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pure technology.</a> Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).</li>
<li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).</li>
<li>Shepherd, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li>
<li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
<li>Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnePot+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">OnePot PURE cell-free system.</a> J Vis Exp. (172), e62625(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+protein+expression+in+the+One-Pot+PURE+system%3A+insights+into+reaction+composition+and+translation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency.</a> ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).</li>
<li>Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+regeneration+from+pyruvate+in+the+PURE+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP regeneration from pyruvate in the PURE system.</a> ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).</li>
<li>Doerr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+with+minimal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems.</a> Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).</li>
<li>Christodoulou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+NMR+investigations+of+dynamic+regions+of+intact+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes.</a> PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).</li>
<li>Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+all-E+coli+TXTL+toolbox+3.0%3A+new+capabilities+of+a+cell-free+synthetic+biology+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform.</a> Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).</li>
<li>Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+template+preparation+on+variability+in+cell-free+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production.</a> Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).</li>
<li>Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+as+a+method+to+rapidly+screen+machine+learning-generated+protease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants.</a> ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).</li>
<li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaohakunakorn%2C+N+%22Cell-free+3PGA+energy+solution%22">Cell-free 3PGA energy solution</a>. , Protocols.io. (2020).</li>
<li>Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+on+ribosomal+peptidyltransferase%3A+the+behaviour+of+the+inhibitor+blasticidin+S%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S.</a> Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).</li>
<li>Blaha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+functional+ribosomal+complexes+and+effect+of+buffer+conditions+on+tRNA+positions+observed+by+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy.</a> Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x YT</td><td>Sigma</td><td>Y2377-250G</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio senza RNAsi</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9070G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma</td><td>09718-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A8351-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) competente per E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>bottiglia, centrifuga (Nalgene)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120-9500</td><td>Bottiglia di copolimero di polipropilene</td></tr><tr><td>bottiglia, vetro (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 L</td><td>VWR</td><td>215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596</td><td></td></tr><tr><td>Analisi Bradford, Quick Start 1x Reagente di Colorante</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga, micro</td><td>Eppendorf</td><td>5424R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Colonna cromatografia</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di creatina</td><td>Sigma</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette, semi micro 1,6 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>FB55147</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodico idrogeno ortofosforato diidrato</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4450/60</td><td></td></tr><tr><td>cassetta per dialisi, Slide-A-Lyzer G3, MWCO da 2 kDa, 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>A52962</td><td></td></tr><tr><td>Idrogeno dipotassico ortofosfato anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/5240/60</td><td></td></tr><tr><td>DTT No-Weigh</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>unità filtrante, MWCO Amicon Ultra 15 centrifugo da 3kDa</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>fiaschetta, 500 mL</td><td>VWR</td><td>214-1133</td><td></td></tr><tr><td>fiaschetta, con un perlezione 2.5 L&nbsp;</td><td>Tunair</td><td>SS-5013</td><td></td></tr><tr><td>Acido folinico</td><td>Sigma</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Fisherbrand</td><td>H/1200/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Buffer HEPES, soluzione 1 M pH 7,3</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP299</td><td></td></tr><tr><td>imidazolo</td><td>Sigma</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>incubatrice</td><td>Eppendorf</td><td>New Brunswick Innova&reg; 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0392</td><td></td></tr><tr><td>Pellet KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-glutammico sale di emimagnesio tetraidrato</td><td>Sigma</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammico sale monopotassico monoidrato</td><td>Sigma</td><td>49601-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidrato di acetato di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di magnesio</td><td>Fluka</td><td>63020-1L</td><td></td></tr><tr><td>Configurazione di agitazione magnetica</td><td>Stuart</td><td>US152</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Perline NEBExpress Ni-NTA Mag</td><td>NEB</td><td>S1423S</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>pipetta, multicanale Eppendorf Research Plus 30-300 e micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Sigillo adesivo per piastra per lettore di placche</td><td>ExcelScientific</td><td>STR-SEAL-PLT (Sterile)</td><td></td></tr><tr><td>Sigillo traspirante a piastre</td><td>Starlab</td><td>E2796-3005</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione in lamina</td><td>ExcelScientific</td><td>FCS-25</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di targhe</td><td>BioTek</td><td>Sinergia H1</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per piastre</td><td>Allsheng</td><td>MBI100-4A</td><td></td></tr><tr><td>Placca, 384° pozzo</td><td>Thermo Scientific</td><td>242764</td><td></td></tr><tr><td>piatta, 96 pozzi profondi 1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>736-0601</td><td></td></tr><tr><td>piastra di 96 pozzi profondi 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>82.1972.002</td><td></td></tr><tr><td>PCR a piastra a 96 pozzi</td><td>Sarstedt</td><td>721,978</td><td></td></tr><tr><td>Placca, pozzo ottico 96</td><td>Thermo Scientific</td><td>10057581</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogeno ortofosfato di potassio</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/4800/53</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per l'estrazione proteica (BugBuster)</td><td>EMD Millipore</td><td>70584-3</td><td></td></tr><tr><td>resina per purificazione proteica (cOmplete)</td><td>Roche</td><td>5893682001</td><td></td></tr><tr><td>Shaker a giro</td><td>Starlab</td><td>RM-Multi 1</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3105/70</td><td></td></tr><tr><td>sonda di sonicazione, FisherBrand 15-50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>12931181</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120</td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro</td><td>Jenway</td><td>Genova Plus</td><td></td></tr><tr><td>spermidina</td><td>Sigma</td><td>S2626-1G</td><td></td></tr><tr><td>TCEP 0,5 M</td><td>Supelco</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher NTP, Tris bufferato</td><td>Thermo Scientific</td><td>R1481</td><td></td></tr><tr><td>TRNA da E. coli MRE600</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>triptone</td><td>Formedium</td><td>TRP02</td><td></td></tr><tr><td>valvola, grado PCR da 0,2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,737,002</td><td></td></tr><tr><td>tubo, bijoux Sterilin 7 mL polistirene</td><td>Thermo Scientific</td><td>129A</td><td></td></tr><tr><td>tubo, conico (Falcon) 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>tubo, conico (Falcon) 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>tubo, microcentrifuga (Eppendorf) 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>tubo, microcentrifuga (Eppendorf) 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.700</td><td></td></tr><tr><td>valvola, centrifugazione S100 & nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355619</td><td></td></tr><tr><td>valvola, centrifugazione S30 & nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Optima XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Rotore dell'ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Rotore ad angolo fisso 70Ti</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata UltraPure DNase/RNase</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>vortice</td><td>VWR</td><td>444-2791</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Ossassoide</td><td>LP0021T</td><td></td></tr></tbody></table>

perfezionamento della produzione di ribosomi grezzi e pure di onepot per una sintesi proteica riproducibile senza cellule

Refinement of OnePot PURE and Crude Ribosome Production for Reproducible Cell-free Protein Synthesis

Perfezionamento della produzione di ribosomi grezzi e PURE di OnePot per una sintesi proteica riproducibile senza cellule

Recent advances have enabled the Protein synthesis Using Recombinant Elements (PURE) cell-free system to be produced in individual laboratories ...

Abbiamo perfezionato il sistema OnePOT PURE e la preparazione grezza per ribosomi per migliorare la riproducibilità e l'accessibilità, permettendo a più laboratori di costruire e risolvere problemi robusti sistemi cellulari per la ricerca in biologia sintetica. Le sfide sperimentali includono la variabilità da batch a lotto, l'instabilità del vettore di espressione e i ceppi a crescita lenta, tutti elementi che ostacolano la riproducibilità e la costanza delle prestazioni nella preparazione dei sistemi PURE interni. Abbiamo stabilito che un controllo attento della crescita del ceppo, dell'inoculazione e della concentrazione di glicerolo migliora significativamente la riproducibilità e i rendimenti nelle preparazioni OnePOT PURE e ribosomi sia tra utenti che repliche biologiche.Affrontiamo la mancanza di un protocollo riproducibile e accessibile per preparare PURE e ribosomi internamente, aiutando i laboratori a superare barriere tecniche per adottare l'autoresistenza nella ricerca in biologia sintetica. Il nostro protocollo migliora la riproducibilità e la flessibilità standardizzando le condizioni di crescita e l'uso del glicerolo e razionalizza la preparazione dei ribosomi utilizzando solo l'ultracentrifugazione, evitando metodi di purificazione più complessi o costosi. Per cominciare, scongelare i pellet congelati delle cellule BL21 su ghiaccio e aggiungere 50 millilitri di Ribosoma Buffer A in un tubo conico pulito.Usando una pipetta, prendi 100 microlitri di Ribosoma Buffer A dal tubo conico e aggiungili a una fiala DTT senza peso. Aspira delicatamente finché il pellet DTT non è completamente sciolto per creare una soluzione DTT stock a 0,5 molari. Poi, si pipettano 100 microlitri della soluzione DTT a 0,5 molari di origine nel tubo conico da 50 millilitri e si mette il tubo sul ghiaccio.Utilizzando un miscelatore a vortice, risospendere ogni pellet cellulare scongelato nel Ribosome Buffer A con DTT a un rapporto di due millilitri per grammo di pellet cellulare. Combina i campioni sosspesi in un tubo conico e verifica che il volume totale della suspensa sia di 10 millilitri. Ora, dividiamo equamente la suspensa da 10 millilitri in due campioni separati da cinque millilitri in tubi conici etichettati.Fissare i tubi conici in un supporto e lisare le celle usando una sonda di sonicazione raffreddata in un bagno d'acqua ghiacciato. Imposta il sonicatore al 30% di ampiezza con un ciclo di 20 secondi acceso e 20 secondi spento per un totale di 10 cicli. Dopo la sonicazione, si carica ogni campione lisato a 25 millilitri usando il buffer ribosoma A con DTT e si tratta brevemente di un vortice per il mixaggio.Trasferire i campioni lisati da 25 millilitri in due tubi di centrifugazione S30 pre-raffreddati. Mettere i tubi in una centrifuga e girare a 30.000 G per un'ora a quattro gradi Celsius. Successivamente, recupera con cura fino al 75% del surnatante privo di pellet da ciascun tubo S30 per prevenire la contaminazione da membrana.Trasferire il soprandanante recuperato in due tubi S30 preraffreddati puliti. Dopo aver centrifugato nuovamente i tubi per 30 minuti, recuperare fino al 75% del surnatant senza pellet e trasferirlo in due tubi comici puliti da 50 millilitri. Aggiungi il buffer Ribosome A con DTT a ogni tubo finché il volume non raggiunge i 25 millilitri.Trasferire i campioni da 25 millilitri in due ultracentrifughe S100 pulite e pre-raffreddate. Carica i tubi nell'ultracentrifuga e fai girare 100.000 G per quattro ore a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione finale S100, scartare il sovrantante.Usa una pipetta per rimuovere eventuali residui di buffer mentre lavori velocemente per evitare l'asciugatura del pellet. Poi aggiungi 400 microlitri di Ribosome Buffer C ghiacciato con DTT in ogni tubo S100 contenente il pellet ribosomico. Incuba i tubi sul ghiaccio durante la notte in una stanza fredda per permettere al pellet ribosoma di assorbire il tampone.Il giorno seguente, usa una pipetta da un millilitro e una leggera rotazione per sospendere completamente il pellet trasparente del ribosoma halo in tamponamento. Assicurati che solo l'alone trasparente sia sciolto ed evita di disturbare qualsiasi pellet giallo insolubile. Successivamente trasferisci la soluzione risospesa del ribosoma in due tubi microcentrifughe sterili da due millilitri.Centrifugare i tubi a 20.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere materiale insolubile. Trasferisci con cura il surnante senza pellet in un tubo pulito per microcentrifuga e lascialo sul ghiaccio. Scongelare le necessarie aliquote di proteine del sistema PURE, ribosomi, soluzione energetica e soluzione matriciale su ghiaccio.Assemblare un mix master per reazioni triplicate aggiungendo soluzione energetica, proteine PURE, ribosomi, soluzione matriciale e acqua priva di nucleasi nell'ordine specificato. Imposta una pipetta a 5,1 microlitri e aspira il master mix cinque-sei volte per assicurarti che la soluzione sia ben miscelata e omogenea. Utilizzando la pipetta impostata a 5,1 microlitri, distribuire il master mix in tre pozzi separati di una piastra ottica da 384 pozzi, evitando le bolle.Sigilla la piastra a 384 pozzi usando una sigillatura adesiva a piastra adesiva. Tutti e quattro i lotti di reazione PURE preparati dall'utente 1 hanno mostrato cinetica di fluorescenza GFP costante, con picco intorno a due ore, e sono stati comparabili al segnale GFP del lotto preparato indipendentemente dall'utente 2.1, mentre nessuna fluorescenza è stata osservata nel controllo negativo privo di DNA. Al punto di due ore, la fluorescenza della GFP per tutti i lotti PURE preparati dall'utente era altrettanto alta, mentre il controllo del DNA negativo rimaneva vicino alla linea di base.Nelle preparazioni per ribosomi, la produzione di GFP nel tempo variava leggermente tra gli utenti, con l'utente 1.2 che mostrava l'attività più alta, seguito dagli utenti 2.1 e 3.1, mentre l'utente 1.1 aveva il livello più basso tra i lotti attivi. Dopo 1,5 ore, la preparazione ribosomica dell'utente 1.2 ha prodotto la fluorescenza GFP più alta, mentre gli utenti 2.1 e 3.1 hanno avuto valori simili ma leggermente inferiori. L'Utente 1.1 ha avuto il livello più basso tra i campioni attivi, e il controllo del DNA negativo è rimasto vicino a zero.La variazione complessiva tra gli utenti 1,1 e 1,2 è di circa il 30% della produzione di GFP nelle reazioni CFPS diminuita progressivamente con l'aumento delle concentrazioni di glicerolo superiori allo 0%, con il 6% che mostra l'espressione più bassa.

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