Stimolazione delle cellule endoteliali vascolari mediante trappole extracellulari neutrofile in presenza di lipoproteine a bassa densità

Le trappole extracellulari dei neutrofili sono coinvolte in una varietà di malattie, comprese le malattie cardiovascolari. Tuttavia, gli effetti sinergici della formazione di NET e delle lipoproteine sulle cellule vascolari rimangono poco chiari. Utilizzando questo protocollo, sono in corso analisi meccanicistiche di come le risposte infiammatorie sono indotte nelle cellule endoteliali aortiche umane trattate con trappole extracellulari neutrofile e lipoproteine a bassa densità.

Abbiamo dimostrato che le lipoproteine ad alta densità agiscono come soppressore della formazione di NET. Ciò è promosso dalle lipoproteine ossidate a bassa densità, dai fosfolipidi ossidati e dai lisofosfolipidi. Per iniziare, centrifugare da 45 a 50 millilitri di sangue intero umano ottenuto in una provetta di eparina a 700 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Ridurre lentamente la velocità della centrifuga dopo la centrifuga, quindi raccogliere lo strato superiore contenente la frazione plasmatica. Centrifugare la frazione plasmatica due volte a 700 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere completamente le cellule del sangue, mantenendo la stessa impostazione di decelerazione. Quindi aggiungere un microlitro di soluzione EDTA da 250 millimolari per un millilitro di plasma per prevenire l'ossidazione delle lipoproteine mediata da ioni metallici bivalenti.

Mettere 2,7 millilitri di plasma nella provetta dell'ultracentrifuga. Sovrapporre con 900 microlitri di PBS contenente 250 micromolari EDTA. Quindi ultracentrifugare la provetta a 600.000 g per sette minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, scartare 900 microlitri dallo strato superiore per eliminare la frazione chilomicronica. Aggiungere 900 microlitri di PBS contenente EDTA sopra il plasma rimanente e ultracentrifugare a 600.000 G per 2,5 ore a quattro gradi Celsius. Scartare 900 microlitri dello strato superiore per eliminare la frazione lipoproteica a bassissima densità.

Quindi aggiungere 540 microlitri di soluzione di bromuro di potassio da 0,5 grammi per millilitro al plasma per regolare la densità a 1,063. Mescolare delicatamente il contenuto con una pipetta e un'ultracentrifuga a 600.000 G per 2,5 ore a quattro gradi Celsius. Raccogliere 540 microlitri dello strato superiore contenente lipoproteine a bassa densità.

Trasferire la frazione raccolta in una membrana per dialisi e dializzare con due litri di PBS contenente EDTA a quattro gradi Celsius al buio per eliminare il bromuro di potassio. Aggiungere 152 microlitri di polilisina allo 0,01% o soluzione di gelatina allo 0,1% a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per almeno cinque minuti. Quindi rimuovere la soluzione dai pozzetti, lavare una volta con 200 microlitri di acqua sterile e lasciare asciugare completamente i pozzetti a temperatura ambiente.

Conservare il piatto preparato a temperatura ambiente fino a nuovo utilizzo. Preparare le piastre ricoperte di gelatina seguendo la stessa procedura dimostrata per la polilisina. Coltura due volte dieci alla potenza di sei cellule HL60 per 10 millilitri in terreno RPMI-1640, integrato con due micromolari di acido retinoico all-trans.

Dopo quattro giorni di incubazione con acido all-trans retinoico, raccogliere le cellule HL60. Centrifugare le celle raccolte a 220 G per quattro minuti a una temperatura compresa tra 18 e 22 gradi Celsius. Aspirare il surnatante, quindi lavare le cellule con un volume uguale di terreno RPMI-1640 privo di siero.

Centrifugare nuovamente le cellule lavate a 220 G per quattro minuti a una temperatura compresa tra 18 e 22 gradi Celsius e risospendere le cellule in un terreno RPMI-1640 privo di siero. Dopo aver regolato la concentrazione delle cellule a due volte dieci alla potenza di sei cellule per millilitro, seminare 0,5 millilitri di sospensione in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti pre-rivestita con polilisina. Aggiungere 100 microlitri di terreno RPMI-1640 senza siero con o senza 300 nanomolari di forbolo 12-miristato 13-acetato o PMA.

Coltivare le cellule per 30 minuti. Quindi, rimuovi il terreno dai pozzetti. Lavare le cellule una volta con un terreno RPMI-1640 senza siero e sostituirlo con RPMI-1640 senza siero contenente zero o 20 microgrammi per millilitro di lipoproteine a bassa densità.

Continuare a coltivare le cellule per due ore. Raccogliere il terreno di coltura da ciascun pozzetto in una provetta e centrifugare a 700 G per tre minuti a 18-22 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Per la stimolazione, ottenere la coltura di cellule endoteliali aortiche umane e sostituire il terreno esaurito con 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco e incubare le cellule per 30 minuti.

Infine, aggiungere 167 microlitri di terreno di coltura raccolto da cellule simili ai neutrofili contenenti trappole extracellulari di neutrofili e LDL a piastre di cellule endoteliali aortiche umane. La stimolazione delle cellule endoteliali aortiche umane con trappole extracellulari neutrofile ha portato a cambiamenti morfologici dose-dipendenti da una forma simile a un ciottolo a una forma allungata. I cambiamenti morfologici nelle cellule endoteliali aortiche umane sono stati migliorati quando stimolati con trappole extracellulari di neutrofili indotte da LDL, con allungamento visibile evidente già dopo sei ore.