Piattaforma di imaging senza lenti distribuibile sul campo per un'analisi rapida e senza marcatura dell'attivazione delle cellule natural killer

Il nostro obiettivo è valutare rapidamente la funzione immunitaria quantificando l'attivazione delle cellule NK in tempo reale, utilizzando l'imaging label-free e lens-free per migliorare il monitoraggio immunitario. Abbiamo dimostrato che l'indice di immunità innata, o I3, distingue in modo affidabile tra l'attività delle cellule NK di donatori sani e immunocompromessi ed è fortemente correlato con le citochine e i marcatori della citometria a flusso. I saggi esistenti su cellule NK richiedono etichette, strumenti ingombranti e lunghi tempi di incubazione.

La nostra piattaforma LSIT colma questa lacuna consentendo una profilazione rapida, conveniente e senza etichette utilizzando una semplice optoelettronica. La nostra piattaforma LSIT label-free differenzia l'attivazione delle cellule NK a livello di singola cellula entro 30 secondi utilizzando i parametri shadow, eliminando la necessità di colorazione e la costosa citometria a flusso. Estenderemo LSIT per monitorare l'attivazione delle cellule T e B e integreremo algoritmi di deep learning per la classificazione ad alto rendimento di diversi stati delle cellule immunitarie.

Per iniziare, rimuovi i kit per l'isolamento cellulare natural killer, o NK, dal frigorifero e lasciali raggiungere la temperatura ambiente, tra 15 e 28 gradi Celsius. Preparare l'attrezzatura necessaria posizionando un separatore magnetico, pipette con puntali sterili e impostare un'incubatrice o un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius. Utilizzando una pipetta, aggiungere 0,5 millilitri di sangue intero alla provetta di reazione con tappo verde contenente il cocktail di anticorpi.

Mescolare delicatamente il contenuto pipettando su e giù per la provetta cinque o sei volte. Quindi, incubare la provetta per cinque minuti. Trasferire l'intero contenuto della provetta con tappo verde in quella con tappo rosso utilizzando una pipetta e mescolare delicatamente pipettando la provetta cinque o sei volte.

Posizionare la provetta con tappo rosso sul separatore magnetico e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Mantenendo il magnete in posizione, utilizzare una pipetta per trasferire circa 1,5 millilitri di surnatante nella provetta di separazione due con tappo viola. Mescolare delicatamente il contenuto pipettando la provetta cinque o sei volte.

A questo punto, posizionare la provetta con tappo viola sul separatore magnetico e incubare per 10 minuti. Mentre il magnete è ancora in posizione, trasferire circa 1 millilitro di surnatante in una provetta di recupero con coperchio grigio utilizzando una pipetta e mescolare accuratamente il contenuto pipettando la provetta. Quindi, aggiungere 100 microlitri della sospensione di cellule natural killer isolate nel tubo del veicolo e altri 100 microlitri nel cocktail di stimolatori di attivazione, o ASC.

Mescolare delicatamente il contenuto di entrambe le provette utilizzando un miscelatore a vortice per garantire una distribuzione uniforme. Incubare le provette nel blocco riscaldante o nell'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius per un'ora. Accendere la piattaforma LSIT.

Avvia il software di acquisizione LSIT. Accedi inserendo il tuo ID e la password, quindi seleziona Calibra per avviare la modalità di calibrazione. Premere il pulsante Apri sul touchscreen o utilizzare il pulsante fisico della porta scorrevole per aprire il cassetto.

Quando il cassetto si apre, rimuovere la slitta di calibrazione e riporla. Ora, fai clic su Imposta sfondo per calibrare l'intensità ottica. Riposizionare la slitta di calibrazione nel cassetto e chiudere il cassetto.

Quindi, fare clic su Avvia calibrazione per completare il processo. Rimuovere un vetrino di analisi dalla sua custodia. Etichettarlo con i dati di esempio prima di posizionarlo su una superficie piana e pulita.

Pipettare 10 microlitri del campione del veicolo nei canali A e B, quindi pipettare 10 microlitri del campione stimolato con ASC nei canali C e D.Ora, premere Apri per espellere il cassetto. Rimuovere il vetrino di calibrazione e riporlo in una scatola di immagazzinaggio. Inserire il vetrino preparato nel cassetto e premere Chiudi per fissarlo.

Torna al menu principale e seleziona Attività e test delle cellule NK dalla schermata principale. Immettere l'ID del campione o scansionare il codice a barre per caricare il profilo del campione. Quindi, premere Cattura per avviare la registrazione delle immagini.

Dopo aver acquisito l'immagine, fare clic su Analizza per iniziare l'elaborazione. Rivedere la percentuale di attività delle cellule NK e il numero di cellule visualizzati sullo schermo. Scarica i risultati su un'unità USB o stampali utilizzando il menu touchscreen.

Selezionare Conteggio e test delle celle nell'interfaccia principale LSIT. Caricare 10 microlitri del nuovo campione su un canale di saggio fresco utilizzando una pipetta. Inserire la guida nel cassetto.

Chiudere il cassetto utilizzando il touchscreen o il pulsante e inserire l'ID del campione sul sistema. Immettere il fattore di diluizione sul touchscreen, se applicabile, e premere Conteggio per avviare la quantificazione cellulare. Visualizza i risultati visualizzati sullo schermo come celle per microlitro.

Dopo l'analisi, aprire il cassetto premendo il pulsante Apri o attivando l'interruttore fisico. Rimuovere la guida usata dal cassetto usando le mani guantate. Infine, riposizionare la slitta di calibrazione nel cassetto per proteggere il sensore e chiudere il cassetto utilizzando il touchscreen o l'interruttore a levetta fisico.

La piattaforma LSIT con software integrato ha valutato quantitativamente l'attivazione delle cellule NK confrontando i valori CSP delle cellule di controllo attivate e non stimolate. Ha fornito al rapporto sull'immunità una tabella statistica riassuntiva. La stimolazione con ASC ha indotto chiari cambiamenti morfologici nelle cellule NK, tra cui un aumento delle dimensioni e della complessità citoplasmatica, come osservato nei Cytospins colorati con Hema 3 dopo 30 minuti e due ore.

Le immagini ombra hanno mostrato che le cellule stimolate con ASC avevano modelli di diffrazione visibilmente più complessi rispetto ai controlli del veicolo, con parametri estratti che indicavano una maggiore distanza da picco a picco, granularità citoplasmatica e parametro ombra combinato. I valori combinati dei parametri ombra hanno permesso una chiara classificazione tra donatori sani e pazienti oncologici, con una sovrapposizione minima nelle distribuzioni di singole cellule NK attivate e non attivate. I donatori sani hanno mostrato valori di indice di immunità innata significativamente più elevati rispetto ai pazienti oncologici dopo la stimolazione con ASC.