Quantificazione dell'assorbimento endoteliale degli acidi grassi mediante analoghi fluorescenti degli acidi grassi

I nutrienti trasmessi nel sangue, come gli acidi grassi, devono attraversare una barriera endoteliale capillare per entrare nel tessuto metabolico tramite un meccanismo poco compreso. Chiarire questi processi potrebbe rivelare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento delle malattie metaboliche, come il diabete di tipo 2. Abbiamo quindi scoperto che il bisturi muscolale e il tessuto adiposo regolano entrambi l'assorbimento e il trasporto dei lipidi endoteliali utilizzando metaboliti paracrini, in parte controllati anche dal sistema endocrino.

Abbiamo anche scoperto che l'ATP mitocondriale contribuisce inaspettatamente all'assorbimento del grasso endoteliale nonostante la loro nota dipendenza dall'ATP glicolitico. Utilizzando il saggio descritto in questo protocollo, intendiamo approfondire i meccanismi molecolari alla base dell'assorbimento e del trasporto degli acidi grassi endoteliali, incluso come potrebbero essere regolati da altri tessuti. Per cominciare, prepara una soluzione di gelatina allo 0,1% aggiungendo 25 millilitri di stock di gelatina al 2% a 475 millilitri di PBS.

Mescola accuratamente la soluzione di gelatina e sterilizzala con un filtro a vuoto da 0,2 micrometri o autoclave. Utilizzando una pipetta, aggiungi 100 microlitri della soluzione di gelatina allo 0,1% in ogni pozzetto di una piastra nera trasparente a 96 pozzi. Metti il piatto in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti o tutta la notte.

Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di gelatina in eccesso dalla piastra pre-rivestita a 96 pozzi. Lava il piatto con PBS una volta. Poi, pipettare 100 microlitri della cellula in sospensione in ogni pozzo utilizzando una densità di semina che permette alle cellule di raggiungere la confluenza entro il giorno successivo.

Prepara 20 soluzioni millimolari di 3-idrossiisobutirato e lattato come controlli positivi. Per il controllo negativo, usa un micromolare niclosamide. Poi, pipetta le soluzioni in una piastra separata da 96 pozzi.

Lavare le cellule endoteliali una volta con PBS divalente preriscaldato, pipettando con un angolo ripido per evitare di disturbare le cellule placcate. Aggiungi 50 microlitri per pozzo del reagente di trattamento appropriato e incuba la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti o 60 minuti. Per preparare il complesso di acidi grassi BSA di BOBY, miscela una soluzione di acidi grassi BODIPY a 2 micromolari con 1 BSA privo di acidi grassi micromolari in PBS.

Incuba la miscela a temperatura ambiente al buio per 10 minuti prima di utilizzarla. Successivamente, aggiungi 50 microlitri del complesso BSA preparato BODIPY a ciascuno trattato e incuba la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Prepara una soluzione da 1 micromolare di BSA priva di acidi grassi in PBS come tampone di lavaggio e preriscaldala a 37 gradi Celsius.

Rimuovere il complesso di acidi grassi BSA BODIPY dai pozzi e lavare l'intera piastra due volte con 50 microlitri del tampone di lavaggio preriscaldato, eseguendo ogni lavaggio per 1,5 minuti. Poi, aggiungi 50 microlitri di trippan blu allo 0,08% in ciascun pozzo per ridurre la fluorescenza extracellulare. Utilizzando un lettore di microplacche, misura immediatamente la fluorescenza intracellulare.

Dopo aver rimosso la soluzione blu di tripan dai pozzi, lava delicatamente le cellule con PBS. Aggiungi 4 microgrammi per millilitro di colorante Hoechst diluito al 10% di mezzo in ogni pozzo. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Poi, lava il piatto una volta con PBS per rimuovere l'eccesso di colorante. Dopodiché, aggiungi PBS fresco in ogni pozzo e misura la fluorescenza Hoechst usando un lettore di microplacche. Sia nelle cellule HUVEC che in quelle EA.hy926, il segnale intracellulare di BODIPY-C12 è aumentato significativamente con concentrazioni più elevate di acidi grassi BODIPY dopo un minuto, cinque minuti e dieci minuti di incubazione.

Il trattamento con lattato per un'ora ha aumentato l'assorbimento di BODIPY-C12 in modo dosificante a concentrazioni di 5 millimolari e 20 millimolari. Il trattamento con 3-idrossiisobutirato ha inoltre aumentato significativamente l'assorbimento di BODIPY-C12 in modo doso-dipendente, con il massimo assorbimento osservato a 20 millimolari. Il trattamento con 1 micromolare niclosamide per 30 minuti ha portato a una significativa riduzione dell'assorbimento di BODIPY-C12 rispetto al controllo DMSO non trattato.

Dopo un'incubazione di cinque minuti con BODIPY-C16 in HUVEC, il trattamento con lattato a 10 millimolari e 20 millimolari ha significativamente aumentato l'assorbimento in modo doso-dipendente. Il trattamento con 1 micromolare niclosamide ha ridotto significativamente l'assorbimento di BODIPY-C16 rispetto al controllo DMSO non trattato.