Un'analisi R potente e facile da usare di set di dati su larga scala

Miriamo a comprendere la base molecolare alla base di come le piante si difendono dai loro patogeni e, in ultima analisi, utilizzare queste conoscenze per migliorare la salute delle piante e la resa delle colture. Grandi dataset possono essere generati relativamente facilmente in un campo biologico, tuttavia, analizzare tali dataset più ampi in tempi tempi può essere una sfida. Per cominciare, aggiungi i semi a un tubo microcentrifuga con tre fori in cima e posiziona il tubo all'interno di un vaso a campana.

Poi genera vapore di candeggina aggiungendo tre millilitri di acido cloridrico al 36% a 100 millilitri di candeggina domestica in un becher all'interno di una cappa fumiger. Metti il becher nel barattolo a campana e lascialo in una cappa chimica per tre ore. Dopo la sterilizzazione, utilizzando una pipetta Pasteur in vetro sterile, impiattare i semi su piastre medie Murashige e Skoog contenenti lo 0,5% di saccarosio e 0,8% di coclea all'interno di un armadietto a flusso laminare.

Posizionare le piastre di Murashige e Skoog piastrate e sigillate in un ambiente a quattro gradi Celsius per due giorni prima di spostarle in una camera di coltura tissutale impostata su un ciclo di luce di 12 ore e un ciclo di buio di 12 ore. Successivamente, trasferire le piantine su una piastra da 96 pozzi, assicurandosi che ogni pozzo contenga 180 microlitri di mezzo per il saggio. Copri la piastra con un film trasparente e fai due fori per ogni pozzo per aerazione.

Posizionare le lastre per un giorno sotto cicli di luce di 12 ore e cicli di buio di 12 ore, seguiti da un giorno sotto 24 ore di luce costante. Aggiungi trattamenti o soluzioni simulate in ciascun pozzo. Successivamente, registra le letture di luminescenza in condizioni di luce costante impostando il guadagno della lente del filtro a emissione a 3.600 e il tempo dell'intervallo di misura impostato a un secondo, iniziando così l'acquisizione dei dati.

Alla fine della registrazione della luminescenza, scatta una fotografia della piastra a 96 pozzi per documentare la crescita della piantinella. Osserva le curve dei dati del test di luminescenza per confermare la coerenza del trattamento e salva i dati grezzi di luminescenza come file CSV per l'analisi R a valle utilizzando la funzione salva come nel software di analisi dati del lettore di lastre. Dopo aver installato il software RStudio e i pacchetti algoritmici richiesti, seleziona la directory di lavoro dove è memorizzato il file di input, che servirà anche come cartella di output per i risultati.

Poi, seleziona il file CSV di input formattato correttamente. Assicurati che la riga superiore contenga i punti temporali e che la prima colonna elenchi le posizioni dei singoli campioni sulla piastra a 96 pozzi. Nomina i campioni e i trattamenti in base alla disposizione delle piastre a 96 pozzi, assicurandoti che il progetto includa otto repliche per trattamento con un massimo di 12 trattamenti, oppure 12 repliche per trattamento con fino a otto trattamenti.

Se ci sono righe o colonne vuote, assegna nomi come Empty1, Empty2 e così via all'elenco delle etichette di trattamento. Poi, indica l'orario relativo di inizio del test sulla luciferasi in base al momento dell'inizio della luce nella camera. Modifica la sezione User Input II per adattarla a specifiche esigenze di analisi.

Includere la generazione di grafici per curve di luminescenza e per confronti di periodi, fase e ampiezza tra genotipi e trattamenti. Usa il test ANOVA con il test della differenza significativa onesta di Tukey per confrontare i trattamenti in base a periodo, fase e ampiezza. Scegli un trattamento di controllo per l'output dell'analisi o lascia vuoto il campo di controllo per confrontare tutti i trattamenti a coppie.

Opzionalmente, numera i file di output dell'analisi per facilitare il riferimento e l'organizzazione. Ora, usa un test t per confrontare i trattamenti in base al loro periodo, fase e ampiezza. Scegliere se il test t debba essere condotto come confronto a coppie e, in tal caso, specificare se i dati sono accoppiati.

Scegli se arrotondare i punti temporali nel dataset. Se i valori temporali differiscono solo di pochi minuti, arrotondali all'ora più vicina prima di procedere con l'analisi. Ora, imposta il formato di input per l'identificazione del pozzo in base a come il lettore di lastre esporta i dati.

Scegli tra il formato standard in cui i pozzi sono elencati per A1, A2, A3 e così via, oppure il formato alternativo in cui i pozzi sono elencati per A1, B1, C1, eccetera. Poi, esegui l'analisi dei dati della luciferasi cliccando sul pulsante Sorgente situato nell'angolo in alto a destra della console RStudio. Visualizza l'output dell'analisi nella cartella designata, che contiene documenti e sottocartelle che riassumono le statistiche medie di periodo, fase e ampiezza per ogni genotipo e trattamento.

Utilizzando una puntura da biopsia, taglia dischi fogliari di quattro millimetri di diametro dalla quarta alla settima foglia di piante di 25 giorni. Fai galleggiare i dischi fogliari con il lato pelatino rivolto verso l'alto in 100 microlitri di acqua sterile all'interno di una piastra da 96 pozzi. Copri la piastra a 96 pozzi con stagnola pulita e mettila in una camera di crescita chiara e scura per tutta la notte.

Poi, rimuovi la piastra e sostituisci l'acqua sterile con 100 microlitri di soluzione di luminolo. Inizia immediatamente a registrare la luminescenza ogni minuto per 40-60 minuti. Dopo aver scaricato i pacchetti RStudio richiesti, seleziona la directory funzionante.

Seleziona il file di input, assicurandoti che sia un file CSV formattato correttamente. La riga superiore dovrebbe includere i dati delle serie temporali, mentre la prima colonna dovrebbe contenere le posizioni campioni su una piastra a 96 pozzi. Nomina i campioni e i trattamenti in base alla disposizione delle lastre come descritto in precedenza.

Etichetta esplicitamente i pozzi vuoti come Vuoto1, Vuoto2, e così via. Usa il test ANOVA con la differenza significativa onesta di Tukey per confrontare le somme totali di luminescenza tra i trattamenti. Utilizza un test T a due facce quando confronti i dati di solo due trattamenti alla volta.

Genera output grafici che includono curve di fluorescenza e un grafico a barre che mostri la somma totale della luminescenza tra i trattamenti. Aggiungi o deviazione standard o errore standard della media alle barre tracciate. Regola il formato di lettura dell'input in base a come il lettore di piastre fornisce gli identificatori di pozzo.

Scegli tra la lista standard per A1, A2, A3 o la lista verticale per A1, B1, C1.To esegui l'analisi, clicca sul pulsante Source situato nell'angolo in alto a destra della console RStudio. Visualizza l'output nella cartella generata, che contiene più documenti e sottocartelle che riassumono l'analisi completa. Il saggio sulla luciferasi è stato eseguito utilizzando una linea transgenica che esprimeva il reporter luciferasi CCA1 e sette linee transgeniche trasformate indipendentemente che esprimevano il reporter luciferasi GRP7.

Le tracce di luminescenza di queste piante sono state misurate in 168 ore. Utilizzando il metodo R, i parametri di clock calcolati per il reporter luciferasi CCA1 sono stati ottenuti con un'ampiezza di 3.000 unità di luminescenza relativa al secondo per ogni piantinello, un periodo di 23,5 ore e una fase di 3,5 ore. Tutte le linee di luciferasi pGRP7 mostravano valori di periodo e fase simili, ma variavano in ampiezza.

Il periodo di luciferasi pGRP7 è di 24,2 ore, mentre la fase è di 12 ore. Per validare ulteriormente l'analisi R, lo stesso dataset è stato rianalizzato utilizzando BioDare2, una piattaforma online gratuita per l'analisi dei dati circadiani otto, e sono stati ottenuti risultati simili. I dati circadiani generati con celle U2 OS che esprimono il reporter Per2dLuc sono stati rianalizzati utilizzando il metodo R.

Il gruppo di controllo mostrava un'ampiezza di 184,8 unità di luminescenza relativa, un periodo di 23,3 ore e una fase di 2,8 ore. Il knockdown di CRY2, ma non di PSMD4 e PSMD7, ha influenzato significativamente i parametri circadiani, ampiezza, fase e periodo. Questi risultati erano coerenti con quelli pubblicati.

Le nostre ricerche hanno rivelato che l'orologio circadiano è importante per la difesa pianificata contro i patogeni. Abbiamo utilizzato regolarmente il protocollo descritto qui per analizzare dataset di serie temporali su larga scala sia da saghi di clock che da saggio di difesa. Il nostro protocollo che utilizza script R in RStudio offre uno strumento facile da usare e comodo per i ricercatori che lavorano con dati di serie temporali su larga scala.

Il nostro protocollo, è facile da usare, ha molteplici opzioni statistiche e permette a un principiante che non ha conoscenze pregresse di R o esperienza di programmazione di utilizzarlo.