Valutazione dell'effetto dei fattori SASP sulla proliferazione delle cellule tumorali utilizzando un'analisi comparativa di tre metodologie distinte

Le cellule tumorali senescenti secernono tali fattori che influenzano le cellule vicine. Presentiamo tre modelli in vitro per studiare gli effetti paracrini e giustacrini guidati da SASP sulla proliferazione delle cellule HeLa, il monitoraggio in tempo reale dell'impedenza e l'analisi dinamica, cinetica e morfologica abilitata da cellule vive, rivelando effetti paracrini senescenti e microambientali oltre i tradizionali saghi endpoint. Per cominciare, accendi il sistema di analisi delle celle in tempo reale prima dell'innamoramento delle celle.

Avvia la versione 2.0 del software RTCA. Clicca sul pulsante X note e inserisci i dettagli sperimentali. Clicca sul pulsante Programma e aggiungi due passaggi per registrare il background e monitorare la proliferazione cellulare ogni 15 minuti per 72 ore.

Scegli il primo passaggio e clicca su Play. Aggiungi manualmente 50 microlitri di mezzo completo a ciascun pozzo della visuale a piastra elettronica. Successivamente, lava sia le cellule HeLa senescenti che quelle non senescenti con cinque millilitri di PBS sterile e preriscaldato.

Dopo l'aspirazione, aggiungi un millilitro di tripsina preriscaldata allo 0,05% e incuba. Neutralizza la tripsina con cinque millilitri di DMEM completo integrato con antibiotici. Poi, centrifuga le celle a 500 G a temperatura ambiente per 10 minuti.

Dopo aver eliminato il surnatante, risospendere i pellet cellulari in cinque millilitri di DMEM completo integrato con antibiotici. Ora, semina cellule HeLa non senescenti in ogni pozzo di una vista e-plate su 100 microlitri di DMEM completo integrato con antibiotici. Posizionare la visuale e-plate nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale per permettere alle cellule di attaccarsi alla superficie della piastra nell'incubatore.

Scegli il secondo passaggio e clicca su Play per iniziare la misurazione dell'impedenza. Le cellule semi nella piastra elettronica inseriscono pozzi contenenti 60 microlitri di DMEM completo integrato con antibiotici in tre diversi sistemi sperimentali. Mantieni l'inserto della piastra elettronica a 37 gradi Celsius in un incubatore con anidride carbonica al 5% per sei ore per l'attacco.

Clicca Pausa dopo sei ore di semina cellulare, poi aspira delicatamente il mezzo colturale da ciascun pozzetto della visuale della piastra elettronica per rimuovere cellule siere e non aderenti. Lava i pozzi due volte con PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius. Aggiungi 140 microlitri di DMEM senza siero in ciascun po' della vista e-plate.

Rimuovi il substrato. Lava i pozzi dell'inserto e-plate con PBS, poi aggiungi 60 microlitri di DMEM senza siero. Ora, posiziona l'inserto della piastra elettrica nella visuale della piastra elettronica.

Premi delicatamente finché l'inserto non è completamente seminato nel pozzo. Inserire la piastra combinata nel sistema di analisi delle celle in tempo reale. Clicca su Play per riprendere il monitoraggio in tempo reale dei valori dell'indice delle celle ogni 15 minuti tramite il software.

Normalizzare i valori dell'indice delle celle nel momento in cui la vista della piastra elettrica e l'inserimento della piastra elettronica vengono combinati e inseriti nel sistema di analisi delle celle in tempo reale. Successivamente, premi il pulsante Analisi dei Dati per calcolare il tasso e la quantità di proliferazione utilizzando i dati sull'indice e la pendenza massima delle celle ottenuti dal sistema di analisi cellulare in tempo reale. Poi, analizza i dati utilizzando un programma statistico appropriato.

Aspirare il mezzo di coltura da entrambe le piastre a sei pozzi contenenti le cellule HeLa senescenti e non senescenti. Lavare le cellule due volte con PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius per rimuovere residui di siero e detriti cellulari. Aggiungere due millilitri di substrato DMEM senza siero integrato con antibiotici in ciascun pozzo, poi incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 48 ore.

Raccogli il materiale condizionato da ogni pozzo in tubi sterili in un armadietto di sicurezza laminare. Centrifugare il materiale condizionato raccolto a 1000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari, seguita da centrifugazione a 10.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il sovrantantante chiarito. Successivamente, centrifugare il mezzo condizionato utilizzando unità di filtro ultra-centrifugo da due millilitri a quattro gradi Celsius per 60 minuti a 3000 g per concentrarlo a 400 microlitri.

Diluire il concentrato ottenuto con un mezzo fresco senza siero per preparare un mezzo condizionato concentrato 1x, 2x e 3x in tubi sterili in una cabina di sicurezza laminare. Quando le cellule si sono attaccate, aspira delicatamente il mezzo di coltura da ciascun pozzo della vista della piastra elettronica per rimuovere cellule siere e non aderenti e lavare con PBS. Successivamente, una pipetta di 200 microlitri ha preriscaldato i mezzi condizionati raccolti a 37 gradi Celsius in ciascun gruppo.

Inserisci la vista e-plate nel sistema di analisi cellulare in tempo reale e clicca su Play per riprendere il monitoraggio in tempo reale dei valori dell'indice delle celle a intervalli di 15 minuti per 48 ore. Smontare le cellule semi su un micro vetrino sotto tre impianti sperimentali e incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con anidride carbonica al 5%. Dopo otto ore di attacco, lavare le cellule due volte con PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Aggiungi 200 microlitri di Dulbecco's Modified Eagle's Medium senza siero in ogni pozzo. Accendi il regolatore di temperatura 2002-2 e impostalo a 37 gradi Celsius. Accendi il CO2-Controller 2000 e impostalo al 5% di anidride carbonica.

Accendi la sorgente luminosa a fluorescenza. Posiziona il vetrino sulla camera di incubazione sopra il palco. Avvia il software sul computer.

Seleziona l'obiettivo 20x. Aggiungi il canale di contrasto di fase e il canale FITC di fluorescenza. Usando il controller di palco, segna le posizioni per ogni posizione.

Imposta l'intervallo di tempo a 30 minuti e la durata dell'acquisizione a 48 ore, poi avvia l'acquisizione. Contare le cellule positive a proteine fluorescenti verdi in entrambi i momenti temporali e calcolare l'aumento percentuale per l'analisi. Il trattamento con Doxorubicina ha indotto significativamente la senescenza cellulare nelle cellule HeLa.

La quantificazione delle cellule SA-beta-gal-positive ha mostrato una percentuale significativamente più alta nel gruppo trattato con doxorubicina rispetto al gruppo di controllo. Nel primo approccio, le cellule HeLa non senescenti co-colte con cellule HeLa senescenti hanno mostrato un tasso e una capacità di proliferazione significativamente maggiori rispetto alle cellule co-colte con cellule HeLa non senescenti. I mezzi condizionati derivati da cellule HeLa senescenti a concentrazioni 2x e 3x aumentarono significativamente il tasso di proliferazione e la capacità delle cellule HeLa non senescenti rispetto ai mezzi condizionati delle cellule non senescenti.

Nel terzo approccio, dopo 48 ore di co-coltura, le cellule HeLa positive a GFP hanno mostrato un aumento significativamente maggiore della proliferazione quando co-colte con cellule HeLa senescenti rispetto a co-colture non senescenti o controlli solo con GFP.