Rivelazione del controllo elettromeccanico dell'omeostasi tissutale utilizzando un dispositivo microfluidico a due strati

Applichiamo campi elettrici controllati per studiare come i tessuti rispondono ai segnali elettrici, concentrandoci su come le correnti o i campi regolano l'adesione, la proliferazione e l'estrusione cellulare, influenzando l'omeostasi dei tessuti. Abbiamo scoperto che la direzione delle correnti fisiologicamente rilevanti determina gli stati dei tessuti. Il campo apicale e basale induce un fenotipo proliferativo, mentre il campo basale-apicale promuove l'estrusione cellulare, consentendo la modulazione della densità cellulare complessiva.

Mentre gli studi bioelettrici quantitativi si sono a lungo concentrati sulla migrazione attraverso la gravitassi, l'omeostasi dei tessuti rimane inaccessibile. Il nostro sistema consente ora di studiare direttamente come i cartoni fisiologici regolano l'organizzazione e il mantenimento dei tessuti. Il nostro protocollo integra la microfluidica, la stimolazione elettrica dei tessuti, la microscopia della struttura e della forza e l'imaging dal vivo per studiare il controllo elettromeccanico dell'omeostasi tissutale.

Il nostro lavoro ha rivelato le regole fondamentali dell'accoppiamento elettromeccanico. Con nuovi strumenti, possiamo ora esplorare come emergono i modelli bioelettrici nativi e regolano i tessuti e se possiamo controllare il comportamento dei tessuti complessi sintonizzando questi segnali elettromeccanici. Per iniziare, posizionare uno strato pulito di polidimetilsilossano, o stampo PDMS, a faccia in su su un tappo di plastica pulito e aggiungere lentamente 500 microlitri di adesivo liquido polimerizzabile ai raggi ultravioletti sullo stampo.

Utilizzando una spatola, bagnare accuratamente tutte le strutture sporgenti e rimuovere eventuali bolle d'aria formate durante il processo di bagnatura. Premere delicatamente un vetrino coprioggetti sullo stampo PDMS e utilizzare un tergicristallo da laboratorio per rimuovere l'adesivo polimerizzabile ai raggi ultravioletti in eccesso, assicurandosi che il lato superiore del vetrino coprioggetti rimanga pulito e piatto. Polimerizzare la struttura parzialmente sotto una luce ultravioletta illuminata uniformemente con una lunghezza d'onda compresa tra 363 e 370 nanometri.

Pulisci eventuali segni con etanolo al 75%. Quindi, tenere saldamente la struttura su una superficie piana e staccare lentamente lo stampo PDMS da quello dello strato polimerizzato. Quindi, posizionare uno strato pulito di due stampi PDMS a faccia in giù su una lastra PDMS piatta più spessa di 2,5 millimetri.

Picchiettare delicatamente le caratteristiche dello stampo dall'alto usando una pinzetta. Osservare l'interfaccia sotto le funzioni per verificare l'oscuramento o il contrasto ottico, che conferma il corretto contatto. Ora, riempire lo spazio tra lo stampo PDMS e la lastra con adesivo liquido polimerizzabile ai raggi ultravioletti per azione capillare.

Polimerizzare parzialmente la struttura sotto la luce ultravioletta per 10 secondi, come dimostrato in precedenza. Utilizzare una pinzetta morbida imbottita per staccare delicatamente lo strato adesivo composito polimerizzabile ai raggi ultravioletti e lo stampo PDMS dalla lastra PDMS. Se necessario, tagliare i bordi in eccesso dello strato adesivo polimerizzato con forbici affilate.

Quindi, posiziona lo strato uno attaccato a un vetrino di vetro rettangolare su una superficie piana. Allinea lo strato due, ancora attaccato al suo stampo PDMS, con lo strato uno e premi saldamente entrambi gli strati insieme fino a quando non appaiono ombre sotto le caratteristiche. Polimerizzare la struttura allineata sotto la luce ultravioletta per 10 secondi per legare gli strati uno e due in un chip microfluidico a due strati, quindi staccare delicatamente lo stampo PDMS dal chip incollato.

Pipettare immediatamente 10 microlitri di soluzione di precursore del gel di poliacrilammide al centro della regione tissutale direttamente sopra la fessura nel secondo strato. Premere delicatamente un vetrino coprioggetto rotondo, di 10 millimetri di diametro, sulla gocciolina per formare un gel piatto. Osservare il flusso della soluzione in gel nello strato uno attraverso la fessura e fermarsi alla fila di pilastri della barriera.

Polimerizzare immediatamente il chip microfluidico assemblato sotto la luce ultravioletta per cinque minuti. Quindi, lasciare il chip indisturbato per circa un'ora per consentire al gel di poliacrilammide di solidificarsi completamente. Successivamente, incubare il chip microfluidico in un tampone HEPES 0,1 molare a pH 7,4 per almeno un'ora per idratare il gel e ridurre l'adesione tra il gel e il vetrino coprioggetti.

Quindi, usa delicatamente una pinzetta affilata per rimuovere il vetrino coprioggetto dalla superficie del gel. Posizionare una cartuccia in policarbonato per uso medico su una superficie piana con la parte inferiore rivolta verso l'alto e allineare un chip essiccato a faccia in giù con la cartuccia. Pipettare l'adesivo polimerizzabile UV nelle fessure tra il chip e la cartuccia, riempiendole tramite effetto capillare, e polimerizzarlo sotto la luce UV.

Sterilizzare i dispositivi microfluidici fabbricati posizionandoli sotto la luce ultravioletta a 200-280 nanometri all'interno di una cabina di biosicurezza. Preparare il volume richiesto di 50 microgrammi per millilitro di collagene una soluzione funzionante in 1X DPBS su ghiaccio. Su ghiaccio, preparare la soluzione di lavoro Sulfo-SANPAH diluendo due microlitri di soluzione madre Sulfo-SANPAH, precedentemente disciolta in dimetilsolfossido anidro in 80 microlitri di tampone HEPES molare freddo 0,1 a pH 7,4 conservato a quattro gradi Celsius.

Tamponare i bordi del gel di poliacrilammide con salviette da laboratorio per asciugarlo all'interno del dispositivo. Pipettare 80 microlitri di soluzione di lavoro Sulfo-SANPAH sulla superficie del gel, garantendo un'immersione completa, e posizionare il chip sotto la luce ultravioletta per cinque minuti per attivare Sulfo-SANPAH. Sciacquare il gel tre volte con tampone HEPES molare freddo da 0,1 molari a pH 7,4.

Ripetere il trattamento Sulfo-SANPAH pipettando 80 microlitri di soluzione di lavoro SS sul gel e irradiandolo sotto la luce ultravioletta per cinque minuti. Questa volta, risciacquare il gel tre volte con 1X DPBS freddo. Infine, pipettare 100 microlitri di una soluzione di collagene sul gel di poliacrilammide, garantendo una copertura completa, e lasciarlo agire per un'ora.

Risciacquare tre volte il collagene non attaccato con 1X DPBS, quindi tenere il gel immerso in 1X DPBS fino a nuovo utilizzo. Fissare i dispositivi agli inserti utilizzando le viti. Quindi, fissare fino a quattro gruppi di inserti del dispositivo al supporto progettato per il montaggio su un tavolino per microscopio.

Aggiungere due millilitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto principale dei dispositivi e attraverso i canali di rimozione dei rifiuti per eliminare e sostituire il DPBS 1X. Quindi, inserire gli elettrodi di platino nel tubo contenente 45 millilitri di terreno, assicurandosi che siano completamente immersi nel fluido. Tirare il terreno di coltura attraverso il tubo Tygon con una siringa e agganciarlo saldamente.

Collegare un'estremità del tubo a riempimento medio alla camera dell'elettrodo e l'altra estremità al dispositivo. Ora, preparare una sospensione cellulare seguendo le raccomandazioni per la tripsinizzazione o la preparazione della sospensione cellulare e seminare 0,1 milioni di cellule nel pozzetto principale. Montare la configurazione sul microscopio con le camere degli elettrodi sui lati e collegare il misuratore di sorgente alla camera degli elettrodi.

Utilizzare tre dispositivi con resistenza del canale identica. Assegnane uno come gruppo di controllo. Applicare la corrente apicale a quella basale al secondo dispositivo e la corrente basale a quella apicale al terzo dispositivo.

Genera un segnale elettrico in modalità pinza amperometrica e fornisce una corrente totale di 20 microampere. Scegli l'obiettivo 20X per l'imaging dell'intero tessuto con un microscopio a epifluorescenza. Infine, scegli il canale 561 per la fluorescenza rossa e i canali a campo chiaro.

Selezionare un intervallo di tempo di un'ora durante l'imaging a lungo termine. La stimolazione elettrica è stata applicata perpendicolarmente alle cellule per interrompere il potenziale transepiteliale per studiare il suo ruolo nel comportamento dei tessuti in diverse direzioni di corrente. L'imaging a contrasto di fase, le correnti apicali o basali o ATB hanno causato l'illuminazione delle giunzioni cellulari entro 10 minuti dall'applicazione, mentre le condizioni di controllo e da basale ad apicale, BTA, hanno mostrato un basso contrasto e superfici apicali piatte.

Le correnti ATB hanno prodotto una convessità verso l'esterno sulla superficie della cellula apicale. La deformazione del gel era fortemente dipendente dalla direzione della corrente. Le correnti ATB hanno tirato il gel verso l'alto, mentre le correnti BTA hanno compresso il gel verso il basso.

L'intensità della caderina E giunzionale è aumentata sotto le correnti BTA, ma è diminuita significativamente sotto le correnti ATB rispetto al controllo. L'intensità dell'actina giunzionale è diminuita sotto le correnti ATB, ma non è aumentata significativamente sotto le correnti BTA rispetto al controllo. Le correnti ATB hanno innescato estrusioni multicellulari di cellule vive attraverso il monostrato, mentre le correnti BTA hanno mantenuto la struttura del monostrato, simile al controllo.

L'eterogeneità spaziale nella distribuzione cellulare era significativamente più alta in presenza di correnti ATB, ma rimaneva bassa e uniforme in condizioni di BTA e di controllo. I tassi di proliferazione cellulare sono aumentati sotto stimolazione dell'ATB, con tassi di divisione più elevati nel tempo. Al contrario, le correnti BTA hanno indotto più eventi di morte cellulare.