Dissezione dei tessuti craniofacciali di pesce zebra dopo colorazione con blu di Alcian

Stiamo esplorando i meccanismi con cui il palato del pesce zebra cresce nel tempo utilizzando campioni fissi e l'imaging time lapse di embrioni con un'elevata risoluzione temporale spaziale utilizzando la microscopia a foglio di luce. Il nostro protocollo è semplice e facile da seguire. Stabilisce passaggi dettagliati per sezionare e separare le cartilagini craniofacciali di una larva di pesce zebra di cinque giorni.

Questo protocollo ha permesso un'attenta caratterizzazione della forma del palato su scala tissutale e cellulare, permettendoci in ultima analisi di valutare l'effetto degli antigeni di commento sulla morfogenesi del palato. Per iniziare, procurati da 20 a 25 larve di pesce zebra anestetizzate e rimuovi l'anestetico una volta che le larve hanno smesso di muoversi. Aggiungere 1,5 millilitri di aldeide paraforme al 4% al tubo e posizionare il campione su un bilanciere impostato a 60 giri al minuto a temperatura ambiente per due ore.

Utilizzando una pipetta, rimuovere la maggior quantità possibile di fissativo dal tubo. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di etanolo al 50% al campione e posizionarlo su un bilanciere a temperatura ambiente impostata su 60 giri al minuto per 10 minuti. Ora, utilizzando una pipetta, aspirare l'etanolo dalla provetta e aggiungere 1,5 millilitri di soluzione di colorante blu alciano al campione.

Incubare le larve nella soluzione colorante per 18-20 ore a temperatura ambiente mentre si dondola a 60 giri al minuto. Successivamente, rimuovere la soluzione colorante utilizzando una pipetta e lavare le larve con 1,5 millilitri di acqua distillata per uno o due minuti su un bilanciere a temperatura ambiente. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di candeggina al campione e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti senza coprire le provette.

Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione di candeggina dal campione e trattare il campione con le soluzioni per la pulizia dei tessuti uno e due. Dopo aver rimosso la soluzione due, aggiungere da 1,5 a due millilitri di soluzione di conservazione al campione. A causa del contenuto di glicerolo, osservare come i campioni colorati sprofondano gradualmente sul fondo entro 10 minuti.

Mettere una larva macchiata sul lato laterale nella capsula di Petri rivestita di agarosio. Usando una pinza, raschiare delicatamente il tuorlo dal corpo delle larve. Dopo la rimozione del tuorlo, trasferire le larve in una capsula di Petri fresca per evitare interferenze durante la dissezione, tenere le larve vicino alla parte posteriore della testa usando un paio di pinze.

Con un altro paio, rimuovere con cura gli occhi senza danneggiare le strutture craniche facciali circostanti. Tenendo la larva, sempre con un paio di pinze, praticare un'incisione al centro del tessuto dorsale al neurocranio. Quindi pizzica e stacca il cervello e i tessuti associati.

Quindi, separa la testa delle larve dal resto del corpo. La regione della testa risultante dovrebbe includere il neurocranio e il cranio viscerale ancora attaccato alle estremità anteriore e posteriore. Recidere con cura i due punti di collegamento tra il neurocranio e il cranio viscerale con una pinza per separarli completamente.

Infine, posizionare una o due gocce di glicerolo al 100% su un vetrino pulito e trasferire il neurocranio sezionato o il cranio viscerale sul vetrino. Usando una pinza, posiziona delicatamente un vetrino coprioggetti sopra i fazzoletti assicurandoti che non rimangano intrappolate bolle d'aria e sigilla il vetrino coprioggetti con smalto per unghie prima dell'imaging. Il neurocranio sezionato mostrava molteplici strutture chiaramente etichettate, tra cui la placca etmoidea, la trabecola e la cartilagine pericardica, consentendo un'analisi strutturale dettagliata.

Il cranio viscerale comprendeva la cartilagine di Meckel e altri elementi come il palato quadrato e le cartilagini basilbranchiali. La colorazione con blu di Alcian a cinque giorni dalla fecondazione ha permesso una chiara visualizzazione della piastra etmoidale. La larghezza e la lunghezza della lastra etmoidale sono state misurabili in modo coerente utilizzando l'analisi delle immagini e la lunghezza è stata significativamente maggiore della larghezza e i dati quantificati da 15 campioni.

L'area della placca etmoidale è stata estratta dai dati dell'immagine e confermata attraverso la quantificazione con chiari segni di confine. Nella placca etmoidale sono state osservate disposizioni cellulari distinte con cellule cuboidali nella regione mediale e cellule columeri nelle parti laterali. La colorazione Dappy ha permesso la visualizzazione dei singoli nuclei cellulari all'interno della piastra etmoidale.