Name: Rilevamento del comportamento soggetto allaggregazione nelle cellule mutanti di cancro al seno P53 V157F utilizzando la fluorescenza multipunto della tioflavina T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T14:57:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Scopri come rilevare l'aggregazione della proteina p53 V157F nelle cellule di cancro al seno utilizzando la fluorescenza multipunto della tioflavina T. Questo metodo migliora l'accuratezza nella quantificazione delle strutture amiloidi.

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<ol><li>Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awakening+the+%26%2334%3Bguardian+of+genome%26%2334%3B%3A+Reactivation+of+mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Awakening the &#34;guardian of genome&#34;: Reactivation of mutant p53.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+affordable+method+to+create+nonsense+mutation+clones+of+p53+for+studying+the+premature+termination+codon+readthrough+activity+of+ptc124%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124.</a> Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).</li>
<li>Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aggregation+of+mutant+p53+produces+prion-like+properties+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer.</a> Prion. 8 (1), 75-84 (2014).</li>
<li>Kim, S., An, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+p53+isoforms+and+aggregations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Role of p53 isoforms and aggregations in cancer.</a> Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).</li>
<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutant+p53+promotes+cell+growth+and+cancer+cell+metabolism+via+inhibition+of+ampk+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation.</a> Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutant+p53+in+cancer+progression+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy.</a> J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).</li>
<li>De Oliveira, G. aP., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+status+of+p53+oligomeric+and+aggregation+states+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer.</a> Biomolecules. 10 (4), 548(2020).</li>
<li>Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+p53+pathways%3A+Mechanisms%2C+structures%2C+and+advances+in+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).</li>
<li>Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+thioflavin+t+with+amyloid+fibrils%3A+Stoichiometry+and+affinity+of+dye+binding%2C+absorption+spectra+of+bound+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye.</a> J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).</li>
<li>Cai, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nampt+inhibitor+and+p73+activator+represses+p53+r175h+mutated+HNSCC+cell+proliferation+in+a+synergistic+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner.</a> Biomolecules. 12 (3), 438(2022).</li>
<li>Cai, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyllides+repress+gain-of-function+p53+mutated+hnscc+cell+proliferation+via+activation+of+p73+and+repression+of+p53+aggregation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).</li>
<li>Wu, K. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+anticancer+activity+of+hsp70+inhibitor+and+doxorubicin+in+gain-of-function+mutated+p53+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells.</a> Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).</li>
<li>Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+filter-trap+assay+for+amyloid+fibril+formation+kinetics+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions.</a> ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).</li>
<li>Goldsbury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+structure+and+assembly%3A+Insights+from+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).</li>
<li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibril+specific%2C+conformation+dependent+antibodies+recognize+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils+and+fibrillar+oligomers+that+is+absent+in+prefibrillar+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers.</a> Mol Neurodegener. 2, 18(2007).</li>
<li>Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioflavin+t+as+an+amyloid+dye%3A+Fibril+quantification%2C+optimal+concentration+and+effect+on+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22R+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation.</a> R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).</li>
<li>Biancalana, M., Koide, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+thioflavin-t+binding+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils.</a> Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).</li>
<li>Yang-Hartwich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+protein+aggregation+promotes+platinum+resistance+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer.</a> Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).</li>
<li>Lei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+allosteric+mechanisms+of+the+lung-enriched+p53+mutants+v157f+and+r158l%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l.</a> Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+edge+effect%3A+A+global+problem.+The+trouble+with+culturing+cells+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates.</a> Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).</li>
<li>Yoshimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+crystal-like+amyloid+fibrils+and+glass-like+amorphous+aggregates+from+their+kinetics+of+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).</li>
<li>Yang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+protein-rich+clusters+host+the+nucleation+of+mutant+p53+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).</li>
<li>Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acidic+and+basic+ph+on+thioflavin+t+absorbance+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence.</a> Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).</li>
<li>Bom, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p53+core+domain+is+a+molten+globule+at+low+ph%3A+Functional+implications+of+a+partially+unfolded+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure.</a> J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).</li>
<li>Ano Bom, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p53+aggregates+into+prion-like+amyloid+oligomers+and+fibrils%3A+Implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer.</a> J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).</li>
<li>Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+is+essential+for+restoring+cellular+functions+of+temperature-sensitive+p53+mutant+protein+but+not+for+stabilization+and+activation+of+wild-type+p53%3A+Implications+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy.</a> J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).</li>
<li>Arsic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%94133p53%CE%B2+isoform+pro-invasive+activity+is+regulated+through+an+aggregation-dependent+mechanism+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).</li>
<li>Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta133p53alpha+and+delta160p53alpha+isoforms+of+the+tumor+suppressor+protein+p53+exert+dominant-negative+effect+primarily+by+co-aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation.</a> Elife. 14, RP106469(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Piastra di coltura a 96 pozzi</td><td>Semplicemente</td><td>PC396-0100</td><td></td></tr><tr><td>Contrascorrimento</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Contessa II FL Contatore Automatico delle Celle</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Semplicemente</td><td>CC704-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di Eppendorf</td><td>Semplicemente</td><td>PC101-5000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AAT Bioquest</td><td>17530</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>735-0391&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Trippan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento del comportamento soggetto all'aggregazione nelle cellule mutanti di cancro al seno p53 v157f utilizzando la fluorescenza multipunto della tioflavina t

Detection of Aggregation-Prone Behavior in Mutant P53 V157F Breast Cancer Cells Using Multipoint Thioflavin T Fluorescence

Rilevamento del comportamento soggetto all'aggregazione nelle cellule mutanti di cancro al seno P53 V157F utilizzando la fluorescenza multipunto della tioflavina T

The tumor suppressor p53, encoded by the TP53 gene, plays a central role in maintaining genomic stability. TP53 mutations, particularly hotspot variants, ...

detection-aggregation-prone-behavior-mutant-p53-v157f-breast-cancer

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In questo video, dimostriamo un saggio di aggregazione proteica basato su cellule utilizzando inibitori del proteasoma, che bloccano l'attività del proteasoma, impedendo alle proteine mutanti mal ripiegate, fuse in un'etichetta fluorescente, di subire la degradazione del proteasoma ubiquitina-dipendente, portando al loro accumulo all'interno del citoplasma cellulare. Gli aggregati proteici vengono quindi visualizzati e quantificati mediante microscopia a fluorescenza.

Saggio di formazione di aggregati proteici: un metodo per rilevare e quantificare l'aggregazione proteica in cellule coltivate dopo induzione da parte dell'inibitore del proteasoma

Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati. I cervelli vengono fissati, lavati e trattati con un agente antisbiadimento prima del montaggio. Le immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale e quantificate per osservare la trasmissione di aggregati proteici mutanti.

Imaging e quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati

Proteine ​​tau non modificate e iperfosforilata sono stati utilizzati in due metodiche di aggregazione in vitro per rivelare la cinetica di aggregazione veloce iperfosforilazione-dipendente. Questi test aprono la strada per schermi future per i composti che possono modulare la propensione di tau iperfosforilata a formare fibrille che sono alla base della progressione della malattia di Alzheimer.

In Vitro aggregazione Assays Utilizzando iperfosforilata Tau Protein

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

È dimostrato un immunodosaggio basato su capillare utilizzando una piattaforma commerciale per misurare proteine bersaglio dalle preparazioni di proteine totali. Inoltre, i parametri di analisi del tempo di esposizione, concentrazione nella proteina e diluizione dell'anticorpo sono ottimizzati per un sistema di modello di coltura cellulare.

Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare

Raccogliendo la prova sostiene l'idea che aggregati proteici patogeni associati con malattie neurodegenerative diffuse tra cellule con proprietà simil-da prioni. Qui, descriviamo un metodo che permette la visualizzazione della cellula--cellula diffusione del prione-come i complessi nell'organismo modello, Drosophila melanogaster.

Monitoraggio-cellula-trasmissione degli aggregati della proteina del Prion-come in Drosophila Melanogaster

Qui vi presentiamo un nuovo metodo per la determinazione dell'affinità di legame all'equilibrio e in soluzione con alta sensibilità su larga scala. Questo migliora l'analisi quantitativa di associazione del DNA di fattore di trascrizione. Il metodo si basa su misure di anisotropia di fluorescenza automatizzato in un sistema controllato di consegna.

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

Sono presentati quattro protocolli per costruire e sfruttare i ceppi di reporter del lievito Saccharomyces cerevisiae per studiare il potenziale di trassessione umano P53, gli impatti delle sue varie mutazioni associate al cancro, le proteine interagenti co-espresse e gli effetti di piccole molecole specifiche.

Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

Vi presentiamo un flusso di lavoro liberamente disponibile costruito per una rapida esplorazione e analisi accurata dei corpi cellulari in specifici compartimenti cellulari in immagini di microscopia a fluorescenza. Questo flusso di lavoro user-friendly è progettato sul software open-source E utilizza anche funzionalità ImageJ. La pipeline è conveniente senza conoscere l'analisi delle immagini.

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare il successo del rilevamento dell'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo da pazienti con mieloma multiplo.

Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo

Scopri come rilevare l'aggregazione della proteina p53 V157F nelle cellule di cancro al seno utilizzando la fluorescenza multipunto della tioflavina T. Questo metodo migliora l'accuratezza nella quantificazione delle strutture amiloidi.

Rilevamento del comportamento soggetto allaggregazione nelle cellule mutanti di cancro al seno P53 V157F utilizzando la fluorescenza multipunto della tioflavina T (Video) | JoVE Journal

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