Name: Mutagenesi basata su CRISPR-Cas9 nel Nematode entomopatogeno Steinernema hermaphroditum e il mantenimento delle linee mutanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Impara la mutagenesi CRISPR-Cas9 nel nematode entomopatogeno Steinernema hermaphroditum per studiare funzioni geniche e simbiosi. Questo metodo consente di creare mutanti per analisi funzionali in biologia.

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<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar (80-100 Rete)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26411</td><td>Utilizzato anche nelle piastre di piruvato LB</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td>Utilizzato anche nella genotipizzazione</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nucleasi V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Aghi borosilicati</td><td>Strumento di Precisione Mondiale</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo &nbsp;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 mg/mL di etanolo</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura per il tampone di agarose</td><td>Laboratori di ricerca sul cervello</td><td>#4860-1D</td><td>Spessore No1 di 48 x 60 mm</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>Dimetil Solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>DNA Clean e Concentratore-5&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4x microiniettore con set di testa di impugnatura, 4 portaago taglia 0</td><td>Eppendorf/Calibre</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Larve di 5° stadio di Galleria melonella</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>Sistema di imaging a gel</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di carico gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina (2%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>Primer per la genotipizzazione: DNA oligo, 25 nmol</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Triptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>Utilizzato anche in piastre Dark LB, LB Pyruvate & nbsp;</td></tr><tr><td>Estratto di lievito Gibco Bacto</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>Utilizzato anche in piastre Dark LB, LB Pyruvate & nbsp;</td></tr><tr><td>Set di testa dell'impugnatura: 4 portaago taglia 1</td><td>Calibre</td><td>EPE-5196083008</td><td>(abbinato all'ago di borosilicato 1B120F-4)</td></tr><tr><td>Olio di alocarbonio 700</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Picker a filo di platino rigido per la manutenzione quotidiana</td><td>Ricerca Tritech</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>Inferenza delle modifiche CRISPR (ICE)</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td>Software utilizzato per analizzare sequenze di Sanger al fine di identificare indel</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Estratore laser P-2000</td><td>Sutter</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>Per il buffer M9, utilizzato anche in NGM</td></tr><tr><td>Punta microcaricatore 2x96ST</td><td>Calibre</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore di montaggio micromanipolatore per Zeiss Axio Observer e Axiovert 200</td><td>Ricerca Tritech</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Tritech</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>Nicotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Buffer duplex senza nucleasi</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di stoccaggio per pipette</td><td>Strumenti Sutter</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio, dibase (K2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>KOH per NGM</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio, monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Per il buffer M9, utilizzato anche in NGM</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Aghi di quarzo</td><td>Strumenti Sutter</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditium genoma</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>sh-unc-22 crRNA Alt-R CRISPR-Cas9</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>Utilizzato anche nelle piastre di piruvato M9, Dark LB, LB</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio, dibase (Na2HPO4.7H20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td>Per il buffer M9</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>Utilizzato anche nelle lastre di piruvato LB & nbsp;</td></tr><tr><td>Picker a filo di platino morbido per microiniezione</td><td>Surepure Chemetals</td><td>6824</td><td>Platino 90%, Filo di lega di iridio al 10%, diametro 0,002 pollici x 5 piedi di lunghezza</td></tr><tr><td>Portaago standard</td><td>Ricerca Tritech</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereo</td><td>Leica</td><td>Inveta 3</td><td></td></tr><tr><td>Trealolose</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88195-99</td><td>0,08 M</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>Preadolescenti 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore di montaggio per micromanipolatore verticale</td><td>Ricerca Tritech</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mutagenesi basata su crispr-cas9 nel nematode entomopatogeno steinernema hermaphroditum e il mantenimento delle linee mutanti

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

Mutagenesi basata su CRISPR-Cas9 nel Nematode entomopatogeno Steinernema hermaphroditum e il mantenimento delle linee mutanti

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

Stiamo lavorando sulla genetica della simbiosi dei batteri nematodi, che ha applicazioni agricole. Gli strumenti genetici nei batteri Xenorhabdus sono molto ben sviluppati, ma la genetica EPN rimane limitata, basandosi principalmente su screening RNAi ed EMS. Per cominciare, si ottengono piastre di agar a nematodi con Xenorhabdus griffiniae e Comamonas aquaticus.Prendi nematodi Steinernema hermaphroditum sulle lastre preparate NGM contenenti Xenorhabdus griffiniae. Incubateli a 25-28 gradi Celsius per una crescita ottimale. La sera prima della microiniezione, si prelevano ermafroditi di stadio J3 su piastre di agar NGM fresche seminate con Xenorhabdus griffiniae.Il giorno della microiniezione, scegli giovani ermafroditi adulti per l'iniezione. Estrai la sequenza genica target dal genoma di riferimento Steinernema hermaphroditum usando BlastP. Seleziona un esone codificante precoce, preferibilmente il primo esone, e inserisci la sequenza in CRISPRscan usando le impostazioni predefinite per generare RNA CRISPR candidati.Sparate i principali candidati RNA CRISPR contro il genoma di Steinernema hermafrodito per assicurarvi che non ci siano corrispondenze fuori bersaglio. Conservare gli RNA CRISPR selezionati e gli RNA CRISPR transattivanti universali a 100 micromolari ciascuno in un buffer duplex a meno 80 gradi Celsius. Scioglie il 2% di agarosio in acqua usando un microonde.Trasferire 50 microlitri dell'agarosio fuso su un vetro con copertura. Coprilo immediatamente con un secondo bicchiere di copertura. Dopo un tempo di asciugatura di 20 minuti, rimuovi il vetro superiore del coperchio e poi etichetta il lato anteriore del tampone di agarosio.Conserva i cuscinetti di agarosio a temperatura ambiente per un uso a lungo termine per mesi o anni. Per preparare gli aghi all'iniezione, estrai i capillari di quarzo su un estrattore di filamenti laser e conserva gli aghi in una scatola di stoccaggio per pipette. Prepara nuovi duplex di RNA guida mescolando i crRNA selezionati e gli RNA CRISPR transattivanti universali in un rapporto uno-a-uno.Incubare il tubo a 94 gradi Celsius per due minuti, poi raffreddare a temperatura ambiente per ricottare i duplex. Assemblare il mix di iniezione combinando Cas9, cloruro di potassio e i duplex gRNA e incubare. Muovi tre volte il tubo PCR per mescolarlo, poi fai girare brevemente per 10-15 secondi in una mini centrifuga.Dopo il mixaggio finale, gira per un massimo di un minuto per raccogliere il contenuto. Successivamente, usa una punta per microcaricatore per caricare uno o due microlitri di miscela iniettabile nell'ago. Monta l'ago sul supporto, apri la punta trascinando sopra il nastro a doppia faccia sotto olio di halocarburi.E testare la dimensione dell'apertura usando la funzione clean del microiniettore. Metti una piccola goccia di olio di alocarbonio sul tampone al 2%agarosio. Usando un microscopio dissezionale e un filo di platino morbido, prendi un giovane ermafrodita adulto.Lavalo con un tampone M9 per rimuovere i batteri. Trasferisci il nematode su un tappeto di agarosio e mettilo in una goccia di olio di alocarbonio. Usa il filo di platino morbido per spazzolare delicatamente il nematode finché non lo immobilizza.Monta il pad sullo stadio di microiniezione. Individua un braccio gonadale e penetralo con l'ago. Usa la funzione pulita dell'iniettore per somministrare la miscela di iniezione a 99 libbre per pollice quadrato finché il flusso gonadico non è visibile, confermando l'accesso del reagente al sincizio.Se accessibile, riposizionare lo stadio e iniettare il secondo braccio gonadale in modo simile. Immediatamente dopo l'iniezione, risospendere l'animale iniettato in uno o due microlitri di tampone M9 sul tampone di agarosio. Usa un sottile filo di platino per rimuovere il verme iniettato dal tampone, poi lava via l'olio con il tampone M9 e riportalo sulla piastra NGM di recupero con Comamonas aquatica.Incubare la piastra di recupero a 25 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, isolare ogni nematode P0 iniettato su singole piastre NGM seminate con Xenorhabdus griffiniae. Due RNA CRISPR sono stati progettati per mirare all'omologo Steinernema ermaphroditum dell'unc-22 in siti PAM precedentemente pubblicati.L'analisi di tiri bruschi sui nematodi esposti alla nicotina ha mostrato differenze nette di movimento tra mutanti unc-22 e nematodi di tipo selvatico. La genotipizzazione dei progenitori in contrazione tramite PCR ha mostrato molteplici bande deboli nel sito bersaglio sia per Pam 3 che per Pam 5. Il sequenziamento ha confermato gli eventi di inserimento e cancellazione nel sito UNC-22 target.Il mio laboratorio ha ampliato il mio lavoro post-dottorato in genetica EPN. CRISPR è ora disponibile in tre specie di Steinernema. In questo protocollo, abbiamo stabilito una tecnica efficiente per creare mutanti stabili ed ereditabili utilizzando l'editing genico CRISPR-Cas9.Con un editing genico stabile CRISPR-Cas9, possiamo analizzare i meccanismi molecolari dietro la simbiosi Steinernema-Xenorhabdus.

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