Name: Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Scopri l'imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di neuroni del circuito olfattivo in larve di Drosophila melanogaster. Questo metodo utilizza adesivo tissutale GLUture per immobilizzazione stabile e analisi con script R personalizzati.

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1. Preparazione delle larve di Drosophila di terzo stadio per l'imaging del calcio
<ol>
	<li>Mantenere le mosche con cibo per mosche standard (vedi Tabella dei materiali) a 25 °C, con 50-60% di umidità relativa (UR) e un ciclo luce/buio di 12 ore.</li>
	<li>Esprimere la proteina fluorescente rossa (RFP) per l'identificazione dei neuroni e GCaMP6f (indicatore del calcio) nei neuroni di interesse ('X'), incrociare femmine vergini della linea X-Gal4 con maschi portatori di UAS-GCaMP6f e UAS-tdTomato22. NOTA: Per questo studio, la linea Keystone-Gal4 è stata utilizzata per guidare l'espressione di tdTomato e GCaMP6f in una singola coppia di neuroni locali inibitori (Keystone-LN) nel cervello larvale18,19.</li>
	<li>Dopo aver lasciato accoppiare e deporre le uova per 48 ore i maschi e le femmine, trasferire gli adulti in una fiala fresca.</li>
	<li>Estrarre le larve di terzo stadio (circa 120 ore dopo la deposizione delle uova) facendole galleggiare su una soluzione di saccarosio al 15%. Utilizzare una micropipetta P1000 per trasferire le larve galleggianti in un becher di vetro da 1.000 mL.</li>
	<li>Lavare le larve 3-4 volte sostituendo ogni volta l'acqua nel becher con 800 ml di acqua distillata fresca. Lasciare riposare le larve per 10 minuti prima di procedere con il resto del protocollo.</li>
</ol>
2. Protocollo di fame per le larve di Drosophila di terzo stadio (se si testano condizioni di fame rispetto a quelle di non fame)
<ol>
	<li>Preparare due camere di alimentazione mettendo un quadratino di salvietta da laboratorio in piastre di Petri da 6 cm. Per condizioni di non fame, aggiungere 350 μl di soluzione di saccarosio 0,2 M; in condizioni di fame, aggiungere 350 μL di acqua distillata.</li>
	<li>Trasferire un numero uguale di larve lavate in ciascuna camera di alimentazione. Lasciare che le larve si nutrano di saccarosio (non affamato) o di acqua distillata (affamato) per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
</ol>
3. Imaging del calcio in vivo
NOTA: Tutti gli esperimenti che coinvolgono l'adesivo tissutale devono essere condotti utilizzando le pratiche di sicurezza standard di laboratorio. Sono necessari dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza o una visiera; I guanti di cotone devono essere evitati a causa di reazioni esotermiche con cianoacrilato. Evitare il contatto dell'adesivo con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di incollaggio della pelle, immergere l'area in acqua tiepida e sapone e separare delicatamente; In caso di esposizione agli occhi, sciacquare con acqua tiepida per ≥5 minuti e consultare immediatamente un medico. L'adesivo deve essere tenuto lontano da fiamme libere e calore elevato, poiché l'adesivo indurito può rilasciare fumi irritanti se bruciato. Conservare l'adesivo a ≤30 °C, al riparo dall'umidità e dalla luce diretta del sole, in un contenitore ermeticamente chiuso quando non viene utilizzato.
<ol>
	<li>Preparare il tampone per imaging del calcio con la seguente composizione: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucosio 10 mM e HEPES 10 mM. Conservare a 4 °C quando non in uso. NOTA: La soluzione salina modificata contenente 110 mM di NaCl è una formulazione ampiamente accettata per la dissezione e l'imaging larvale del SNC e rientra nell'intervallo tipico utilizzato negli studi di elettrofisiologia e imaging (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.</li>
	<li>Su un vetro di copertura del microscopio di 24 x 50 mm (1,5 mm di spessore), creare un pozzetto utilizzando la vaselina erogata da una siringa.</li>
	<li>Posizionare una piccola goccia di adesivo topico per tessuti (60% 2-ottile e 40% n-butilcianoacrilato) al centro del vetro di copertura. Stendere l'adesivo in modo uniforme in uno strato sottile e uniforme utilizzando una bacchetta di vetro.</li>
	<li>Trasferire con cura una singola larva sull'adesivo utilizzando un pennello o un filo sottile. Premere delicatamente il lato ventrale della larva sull'adesivo. Lasciare asciugare l'adesivo, assicurandosi che la larva sia completamente immobilizzata.</li>
	<li>Una volta immobilizzata la larva, posizionare il vetro di copertura sul tavolino del microscopio invertito (Figura 1A).</li>
</ol>
4. Imaging del calcio ex-vivo
<ol>
	<li>Preparare il tampone di dissezione larvale con la seguente composizione: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucosio 10 mM e HEPES 10 mM. Conservare a 4 °C quando non in uso.</li>
	<li>Sezionare le dissezioni cerebrali come descritto da Ishimoto e Sano10. Brevemente, usando un pennello o un filo sottile, trasferire una singola larva in una capsula di Petri di 3,5 cm con elastomero siliconico stratificato sul fondo.</li>
	<li>Sotto un microscopio da dissezione, posizionare la larva con il lato ventrale rivolto verso l'alto e localizzare il cervello. Usando le forbici da dissezione, fai un taglio a circa un terzo dell'estremità anteriore della larva. Fai un altro taglio ai ganci della bocca. Preserva il cervello rimuovendo il corpo e i ganci della bocca (adattato da Janelia Flylight Protocol27).</li>
	<li>Identificare il gruppo di nervi contenenti motoneuroni dal midollo ventrale. Usando una pinza, allontana delicatamente il cervello dal resto della larva sezionata. Taglia il tessuto in eccesso dal cervello. NOTA: Maneggiare delicatamente: una forza eccessiva può causare danni ai tessuti poiché il cervello è fragile.</li>
	<li>Preparare un vetro di copertura del microscopio con l'adesivo tissutale per l'imaging del calcio come descritto nei passaggi da 3.2 a 3.3.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta P10, aspirare con cura il cervello sezionato con 5 μl di soluzione di dissezione dalla capsula di Petri. Espellere lentamente il cervello sull'adesivo. Prima che l'adesivo si asciughi, orientare il cervello in una posizione con il lato dorsale rivolto verso l'alto (con i due lobi cerebrali rivolti verso il basso e il cordone ventrale dorsale rivolto verso l'alto).</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta P200, trasferire 100 μl del tampone di imaging del calcio sul cervello larvale immobilizzato sul vetro di copertura.</li>
	<li>Posizionare il vetro di copertura con il cervello sul microscopio invertito, collegato a un modulo scanner confocale a disco rotante e a una telecamera CCD per l'imaging del calcio (Figura 1B). NOTA: Per le preparazioni ex-vivo , assicurarsi di orientare correttamente il cervello mentre la colla è ancora bagnata. Per una qualità dell'immagine ottimale, posizionare il cervello in modo che la ROI sia più vicina all'obiettivo del microscopio ed evitare di applicare una colla in eccesso vicino alla ROI.</li>
</ol>
5. Protocollo di imaging
<ol>
	<li>Aprire il software per l'imaging del calcio utilizzando il microscopio confocale. Acquisizione di immagini utilizzando un obiettivo 10x/1,4 NA con commutazione del filtro tra laser GFP (eccitazione 488 nm, intensità 70%, emissione 525 nm/50 m, OD8) e laser RFP (eccitazione 561 nm, intensità 50%, emissione 610 nm/75 m, OD8). Impostare l'esposizione tra 100 ms e 1.000 ms, il guadagno al 50% del valore di esposizione corrispondente e un fattore di binning di 2 durante l'acquisizione dell'immagine.</li>
	<li>Regola il microscopio su un ingrandimento di 10x e posiziona il cervello sotto l'illuminazione a campo chiaro.</li>
	<li>Identifica il neurone di interesse cercando il segnale tdTomato con il laser RFP (eccitazione impostata a 561 nm). NOTA: Selezionare la saturazione e ridurre la gamma per impostare il valore di esposizione corretto.</li>
	<li>Una volta identificata la regione di interesse (ROI), passare al laser GFP (eccitazione impostata a 488 nm) per catturare i segnali GCaMP6f. Assicurarsi che entrambi i segnali tdTomato e GCaMP siano colocalizzati prima di acquisire le immagini dello stack di entrambi i canali. NOTA: Regola le impostazioni dell'immagine per le registrazioni in stack tdTomato e GCaMP6f per massimizzare la fluorescenza.</li>
	<li>Cattura due registrazioni di serie temporali separate di segnali tdTomato e GCaMP6f contemporaneamente a una velocità di 0,5 fotogrammi/s (per un totale di 2 minuti). NOTA: Il cervello larvale sezionato rimane vitale per circa 10 minuti in queste condizioni tampone; Trascorso questo tempo, i segnali si degraderanno.</li>
	<li>Una volta che il campione è pronto per l'immagine, acquisisci due registrazioni di serie temporali separate dei segnali tdTomato e GCaMP6f contemporaneamente a una velocità di 0,5 fotogrammi/s (per un totale di 2 minuti). NOTA: Il cervello larvale sezionato rimane vitale per circa 10 minuti in queste condizioni tampone; Trascorso questo tempo, i segnali si degraderanno. NOTA: Durante l'esecuzione dell'analisi quantitativa, si consiglia di aumentare la potenza del laser e di regolare il guadagno di esposizione del rivelatore secondo necessità, mantenendo la scala lineare dell'intensità.</li>
</ol>
6. Elaborazione e analisi dei dati
<ol>
	<li>Apri e importa gli stack di segnali tdTomato e GCaMP6f in ImageJ (NIH)28.</li>
	<li>Per identificare la regione di interesse (ROI) corretta, unire i segnali tdTomato e GCaMP6f per confermare la colocalizzazione. Dopo la verifica, dividere i canali tdTomato e GCaMP6f.</li>
	<li>Nel menu in alto, seleziona Plugin | Nuovo, e fare clic su Macro per avviare una nuova macro. Quindi, importare le macro personalizzate basate sul ROI in ImageJ. Seleziona lo stack GCaMP6f e premi Esegui per l'analisi del calcio.</li>
	<li>Elaborare i segnali di fluorescenza utilizzando una macro ImageJ personalizzata (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). La macro genera prima proiezioni di massima intensità, esegue la correzione del movimento utilizzando il plug-in StackReg (modalità di registrazione rigida )29 e applica la correzione della decolorazione.</li>
	<li>Apparirà un pop-up "Azione richiesta" che richiede la selezione manuale del ROI, che consente agli utenti di disegnare manualmente un ROI ampio. Fare clic su OK per continuare l'analisi. Per eseguire la correzione del movimento, assicurati che la casella rettangolare copra l'intero ROI in tutti i fotogrammi per una correzione del movimento accurata, mantenendo la forma spaziale locale e il ROI tra i fotogrammi. NOTA: le registrazioni sono state registrate in ImageJ utilizzando StackReg. Quando il movimento nel piano era grande (spostamento XY cumulativo &gt; 1 μM) o la deriva Z assiale portava alla perdita di messa a fuoco, la registrazione diventava inaffidabile o il campione veniva perso completamente dalla finestra di imaging. Pertanto, i campioni che mostravano una deriva estrema o segnali di calcio in declino (&gt;30%) sono stati automaticamente etichettati ed esclusi dall'analisi a valle per garantire misurazioni accurate dell'attività neuronale. Queste soglie sono coerenti con le pratiche di controllo della qualità comunemente applicate negli studi di imaging del calcio 30,31,32,33. L'esclusione ha inoltre garantito che per le analisi venissero utilizzate solo registrazioni stabili con transitori di calcio affidabili legati allo stimolo.</li>
	<li>Per l'analisi, estrarre tracce di fluorescenza da ROI circolari definite manualmente, guidate dall'autocorrelazione dei pixel; questi ROI comprenderanno l'intero campo dei neuroni chiave.<ol>
		<li>Estrarre i dati grezzi di intensità della fluorescenza per due fluorofori: GCaMP6f/GFP e tdTomato/RFP, utilizzando macro personalizzate in ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Applica una finestra scorrevole con un ROI di 20 x 20 pixel e una dimensione del passo di 10 pixel su tutto il campo visivo. Per ogni ROI, la macro calcolerà: (1) l'intensità in tutti i fotogrammi, (2) la differenza di fluttuazione della linea di base (ovvero la differenza tra i valori di intensità massima e minima durante i primi 10 fotogrammi) e (3) la variazione massima di intensità da fotogramma a fotogramma (ΔF). I ROI che mostrano fluttuazioni di intensità inferiori a 10 unità verranno eliminati e solo i valori ΔF più nitidi saranno selezionati per ulteriori analisi.</li>
		<li>Normalizzare le tracce di fluorescenza utilizzando i seguenti metodi:<ol>
			<li>Normalizzazione Fmax e Fmin: Calcola Δ normalizzato utilizzando la formula: 
			<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq1.jpg" style="margin: auto;"> Dove F è la fluorescenza grezza in ogni punto temporale, Fmin è la fluorescenza minima (linea di base) e Fmax è la fluorescenza massima durante la registrazione.</li>
			<li>Normalizzazione ΔF/F 0: inoltre, eseguire la normalizzazione ΔF/Fo, dove Fo (linea di base) è determinata dai primi 10 fotogrammi di ogni registrazione, utilizzando la formula: 
			<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq2.jpg" style="margin: auto;"> Dove Ft è la fluorescenza al tempo t e F0 è il valore di base calcolato dai primi 10 fotogrammi.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopo aver estratto i segnali GCaMP6f, fai clic con il pulsante sinistro del mouse e seleziona tutto, taglia e incolla per trasferire tutti i valori in un nuovo foglio di calcolo Excel. Nella barra dei menu in alto, seleziona Dati | Testo in colonne. Apparirà un pop-up della procedura guidata "Testo in colonna". Nel passaggio 1, seleziona Delimitato, quindi fai clic su Avanti. Nel passaggio 2, in Delimitatori, selezionare Tabulazione e virgola, quindi fare clic su Avanti. Nel passaggio 3 selezionare Fine. FACOLTATIVO: per tracciare i segnali di calcio normalizzati, evidenziare Fnorm_FminFmax e selezionare Grafico a dispersione.</li>
	<li>Cerca un file .csv che viene generato contenente: (1) valori di fluorescenza grezzi F, (2) ΔF/Fo e (3) Fnorm (intensità di fluorescenza normalizzata). Organizzare il set di dati finale in quattro colonne: (1) tempo (frame), (2) condizione del campione (affamato o nutrito), (3) ID replica (campione singolo) e (4) intensità normalizzata (valori Fnorm scalati da 0 a 1).</li>
	<li>Infine, eseguire l'analisi e la visualizzazione dei dati in R utilizzando script R personalizzati (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. vedere Tabella dei materiali).<ol>
		<li>Importare lo script R personalizzato in un nuovo progetto R. Assicurarsi che i pacchetti R necessari, inclusi ggplot2, dplyr e readr, siano installati e aggiornati prima di eseguire l'analisi.</li>
		<li>A partire dalla riga 1 dello script R personalizzato, premere Esegui continuamente per eseguire l'analisi del calcio. Assicurarsi inoltre che l'output includa mappe di calore che illustrano l'intensità normalizzata del calcio per i primi 30 fotogrammi, 60 fotogrammi e tutti i fotogrammi della registrazione delle serie temporali e boxplot per mostrare la mediana delle intensità normalizzate.</li>
		<li>Valutare il significato dell'intensità di calcio normalizzata utilizzando il test U di Mann-Whitney.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Smaltimento e decontaminazione dei rifiuti
<ol>
	<li>Dopo gli esperimenti, rimuovere i detriti grossolani dagli strumenti e dalle superfici sotto l'acqua corrente, quindi disinfettare con etanolo al 70% o candeggina al 10% seguita da acqua sterile. Lavorare su una superficie disinfettata e lavarsi le mani dopo aver tolto il guanto; Non mangiare o bere in laboratorio.</li>
	<li>Collocare il tessuto larvale e i prodotti monouso contaminati in sacchetti a rischio biologico e in autoclave prima dello smaltimento.</li>
	<li>Gettare i rifiuti di adesivo completamente polimerizzati nella spazzatura generale; L'adesivo non polimerizzato e i prodotti monouso contaminati devono essere raccolti in un contenitore per rifiuti chimici pericolosi sigillato ed etichettato.</li>
	<li>Metti tutti gli oggetti taglienti (lame, aghi, vetri rotti) in un contenitore per oggetti taglienti resistente alla perforazione.</li>
	<li>Raccogliere i solventi infiammabili (etanolo, acetone) in contenitori per rifiuti infiammabili etichettati.</li>
</ol>

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<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).</li>
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<li>Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+facilitation+by+neuropeptide+signaling+mediates+odor-driven+food+search%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search.</a> Cell. 145 (1), 133-144 (2011).</li>
<li>Slankster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+underlying+starvation-dependent+modulation+of+olfactory+behavior+in+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva.</a> Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).</li>
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<li>Murthy, M., Turner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn%3A+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Simpson, J. H., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+and+optogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional imaging and optogenetics in Drosophila.</a> Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Stock per mosche e azioni Manutenzione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cibo per mosche nutrifly</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>UAS-GCaMP6f, tdTomato</td><td>Dono del Dr. JH Kim&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)</td><td>BDSC</td><td>49232</td><td></td></tr><tr><td>Protocollo Reagenti per la Fame</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vasa di Petri da 6 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106G</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per il buffer di imaging e dissezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>J.T. Baker, Avantor Sciences</td><td>JT1311-1</td><td>CAS: 1311-01, 500g</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16828.36</td><td>CAS: 50-99-7, 500g</td></tr><tr><td>HEPES-2-[4-(2-Idrossietil)-1-piperazinil]-acido etanosulfonico</td><td>J.T. Baker, Avantor Sciences</td><td>JT4018-1</td><td>CAS: 4018-01, 100g</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td>CAS: 7786-30-3, 100g</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J64189.36</td><td>CAS: 7447-40-7, 500g</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>EMD Milipore Sigma</td><td>EMD-SX0420-1</td><td>CAS: 7647-14-5, 500g</td></tr><tr><td>Strumenti e reagenti per la dissezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone di dissezione</td><td></td><td></td><td>Composizione fornita nel testo</td></tr><tr><td>Piastre di Petri Olympus, 60 x 15mm ventilate</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>Base Elastomera Sylgard 184</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>24236-10A</td><td></td></tr><tr><td>Agente di polimerizzazione a base elastomera Sylgard 184</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>24236-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Stile 5, EMS</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>78320-5</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas - Filo da taglio da 3mm</td><td>Strumenti scientifici di qualità</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Imaging e Montaggio di Apparecchiature/Reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulo Confocal Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-W1</td><td>collegato al microscopio</td></tr><tr><td>Imaging Buffer</td><td></td><td></td><td>Composizione fornita nel testo</td></tr><tr><td>Microscopio Rovesciato</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8&nbsp;</td><td>Collegato a un modulo scanner confocale a disco rotante e a una fotocamera CCD</td></tr><tr><td>Vetro da copertura microscopica, 24mm x 50mm, spessore # 1.5</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo topico MWI Veterinary GLUTURE</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0632797</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina pura</td><td>Walgreens</td><td>912556</td><td></td></tr><tr><td>Collegamenti a risorse pubbliche</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td></td><td></td><td>https://www.biorender.com/</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>912556</td><td>https://imagej.net/ij/</td></tr><tr><td>Video del protocollo Janelia Flylight</td><td>https://www.janelia.org/</td><td></td><td>https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o</td></tr><tr><td>Mathew Lab Github</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging</td></tr></tbody></table>

imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di drosophila melanogaster di terzo stadio

In-vivo and Ex-vivo Calcium Imaging of an Olfactory Circuit Neuron in the Third-Instar Drosophila melanogaster Larva

Per dimostrare il nostro approccio di imaging larvale del calcio, lo abbiamo applicato con successo sia a preparazioni in-vivo che ex-vivo delle larve di Drosophila (Figura 2 e Figura 3, Video 1, Video 2, Video 3 e Video 4). Abbiamo misurato la dinamica del calcio in larve di Drosophila di terzo stadio che esprimono GCaMP6f e Td-Tomato in una singola coppia di Keystone-LN nel ...

Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio

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Drosophila In Vivo Imaging del calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

Questo video mostra un metodo per l'imaging del calcio in vivo utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente nei moscerini. Descrive i passaggi per preparare i moscerini per la microscopia, condurre il condizionamento olfattivo e visualizzare l'afflusso di calcio indotto dagli odori.

in vivo Imaging del calcio utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente in Drosophila melanogaster

Fonte: Ishimoto, H. et. Al., Imaging del calcio ex vivo per la visualizzazione delle risposte cerebrali alla segnalazione endocrina in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Questo video dimostra l'imaging del calcio da studiareDrosophila risposte cerebrali ai neuropeptidi. I neuroni che esprimono un indicatore fluorescente di calcio rivelano la dinamica intracellulare del calcio e le risposte funzionali alle molecole di segnalazione.

Imaging ex vivo del calcio per studiare le risposte cerebrali della Drosophila ai neuropeptidi

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Qui, discutiamo di un flusso di lavoro per preparare, sezionare, montare e visualizzare cervelli di espianti vivi da larve di terzo stadio di Drosophila melanogaster per osservare le dinamiche cellulari e subcellulari in condizioni fisiologiche.

Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta che esprime GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare gli eventi ictali nella Drosophila adulta attraverso l'imaging del calcio ex vivo , consentendo l'esplorazione dei potenziali meccanismi dell'epilessia a livello cellulare.

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Un approccio di imaging del calcio consente la registrazione delle risposte indotte dal gusto nel cervello dei moscerini svegli mentre una soluzione viene applicata al labello. Le risposte gustative primarie in Drosophila melanogaster sono utilizzate come esempio, ma questo protocollo può essere adattato per studiare i neuroni a valle o altre specie.

In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

Scopri l'imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di neuroni del circuito olfattivo in larve di Drosophila melanogaster. Questo metodo utilizza adesivo tissutale GLUture per immobilizzazione stabile e analisi con script R personalizzati.

Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio (Video) | JoVE Journal

Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio

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