Imaging del calcio in vivo ed ex-vivo di un neurone del circuito olfattivo nella larva di Drosophila melanogaster di terzo stadio

Presentiamo i protocolli di imaging del calcio per un neurone olfattivo larvale di Drosophila , utilizzando un adesivo tissutale topico per l'immobilizzazione. Questo metodo migliora la stabilità, facilitando esperimenti affidabili in vivo ed ex-vivo . Gli script R personalizzati analizzano i segnali del calcio, fornendo una piattaforma efficiente per la ricerca neurofisiologica dettagliata.

Questo protocollo utilizza l'adesivo tissutale GLUture per migliorare la capacità nell'imaging del calcio in vivo ed ex-vivo. Ciò consente ai ricercatori di comprendere le dinamiche del calcio in un neurone del circuito olfattivo nelle larve di Drosophila di terzo stadio. Semplicità ed efficienza dei costi sono i due principali vantaggi di questa tecnica, che rende gli esperimenti più affidabili e accessibili nella ricerca neurofisiologica.

Preparare due camere di alimentazione mettendo un quadratino di salvietta chimica in piastre di Petri di sei centimetri. In caso di fame, aggiungere 350 microlitri di acqua distillata. Per condizioni non di fame, aggiungere 350 microlitri di soluzione di saccarosio 0,2 molare.

Trasferire un numero uguale di larve lavate in ciascuna camera di alimentazione. Lasciare che le larve si nutrano di saccarosio, non affamato, o di acqua distillata, affamata, per due ore a temperatura ambiente Su un vetro di copertura del microscopio di 24 x 50 millimetri, spesso 1,5 millimetri, creare un pozzo, usando la vaselina erogata da una siringa. Posizionare una piccola goccia di adesivo topico per tessuti GLUture al centro del vetro di copertura.

Stendere uniformemente la GLUture in uno strato sottile e uniforme, utilizzando una bacchetta di vetro. Trasferire con cura una singola larva sulla GLUture utilizzando un pennello o un filo sottile. Premere delicatamente il lato ventrale delle larve sull'adesivo.

Lasciare asciugare la GLUture, assicurandosi che le larve siano completamente immobilizzate. Una volta immobilizzata la larva, immergerla in 100 microlitri di tampone di imaging. Posizionare il vetro di copertura su un microscopio invertito Leica DMi8, collegato a un modulo scanner confocale a disco rotante Yokogawa CSU-W1 e a una fotocamera CCD per l'imaging del calcio.

Preparare un vetro di copertura del microscopio con GLUture per l'imaging del calcio, come descritto nei passaggi da 3.2 a 3.3. Completa la dissezione come descritto da Ishimoto e Sano, 2018. Utilizzando una micropipetta P-10, aspirare con cura il cervello sezionato con cinque microlitri di soluzione di dissezione dalla capsula di Petri.

Espellere lentamente il cervello sulla GLUture. Prima che la GLUture si asciughi, orientare il cervello in una posizione dorsale rivolta verso l'alto con i due lobi cerebrali rivolti verso il basso e il midollo ventrale dorsale rivolto verso l'alto. Utilizzando una micropipetta P-200, trasferire 100 microlitri di tampone per imaging del calcio sul cervello delle larve immobilizzate sul vetro di copertura.

Aprite VisiView per l'imaging del calcio, utilizzando il microscopio rotante invertito Leica DMi8. Cattura immagini utilizzando un obiettivo 10X/1.4 con filtri, passando dal laser GFP al laser RFP. I valori di esposizione vanno da 100 a 1000 millisecondi e il guadagno è impostato al 50% del valore di esposizione corrispondente.

Durante l'acquisizione dell'immagine viene applicato un fattore di offerta pari a due. Identifica il neurone di interesse cercando il segnale tdTomato con il laser RFP. Una volta identificata la regione di interesse, passare al laser GFP per catturare i segnali GCaMP6f.

Assicurati che entrambi i segnali tdTomato e GCaMP siano colloquiali prima di acquisire immagini stack di entrambi i canali. Cattura due registrazioni di serie temporali separate dei segnali di successo di tdTomato e GCaMP6f contemporaneamente a una velocità di 0,5 fotogrammi al secondo, per un totale di due minuti. Importa gli stack di segnali tdTomato e GCaMP6f in ImageJ.

Per identificare la regione di interesse corretta, unire i segnali tdTomato e GCaMP6f per confermare la colocalizzazione. Dopo la verifica, dividere i canali tdTomato e GCaMP6f. Importare le macro personalizzate basate sul ROI in ImageJ.

Seleziona lo stack GCaMP6f e premi Esegui per l'analisi del calcio. La macro genera prima proiezioni di massima intensità, esegue la correzione del movimento, utilizzando il plug-in di registrazione dello stack, e applica la correzione del bleach. La correzione del movimento è stata effettuata definendo un'ampia regione rettangolare di interesse, come il lobo cerebrale su ciascun fotogramma.

La scatola rettangolare deve coprire l'intero ROI in tutti i fotogrammi per garantire una correzione accurata del movimento, mantenendo al contempo la forma locale, spaziale e del ROI in tutti i fotogrammi. Ogni ROI, le macro calcolate uno, l'intensità in tutti i fotogrammi, due, la differenza di fluttuazione della linea di base, come la differenza tra i valori di intensità massima e minima durante i primi 10 fotogrammi, e tre, la variazione massima di intensità da fotogramma a fotogramma, Delta F.ROI che mostrano fluttuazioni di intensità inferiori a 10 unità sono stati eliminati. Il set di dati finale è stato organizzato in quattro colonne, una, tempo e intervalli, due, condizioni del campione affamate o alimentate, tre ID replica, campioni individuali e quattro, intensità normalizzata.

Valore della norma F scalato da zero a uno. Infine, l'analisi e la visualizzazione dei dati sono state eseguite in R, utilizzando script R personalizzati. I pacchetti richiesti, tra cui ggplot2, dplyr e readr, sono stati installati e aggiornati prima di eseguire l'analisi.

L'output includeva mappe di calore che illustravano l'intensità normalizzata del calcio per i primi 30 fotogrammi, 60 fotogrammi e tutti i fotogrammi alla registrazione della serie temporale e box plot per mostrare la mediana delle intensità normalizzate. Il significato dell'intensità normalizzata del calcio è stato valutato utilizzando il test U di Mann-Whitney. La prima figura è uno schema per le configurazioni di imaging del calcio in vivo ed ex-vivo.

L'intero campione larvale A, o campione larvale del cervello B, è stato fissato su un sottile strato di GLUture in blu solido, steso all'interno di un pozzetto di vaselina e rotondo su un vetro di copertura del microscopio. I campioni sono stati immersi in un tampone di imaging di calcio, azzurro, e posizionati per l'imaging su un microscopio confocale a disco rotante invertito. Sono state acquisite serie temporali di immagini a fluorescenza di calcio dei campioni.

Lo schema è stato preparato utilizzando BioRender. La seconda figura illustra l'imaging a fluorescenza GCaMP6f. A, immagini divise che mostrano la fluorescenza nel canale a 488 nanometri, GCaMP6f e verde, e il canale a 525 nanometri, tdTomato in rosso.

L'immagine unita viene mostrata nel pannello di destra. B, esempio tracce di fluorescenza grezza nel tempo per GCaMP6f in verde e tdTomato in rosso nei LN keystone. La fluttuazione nella fluorescenza GCaMP6f indica l'attività del calcio, mentre il segnale stabile tdTomato viene utilizzato come controllo per identificare i LN keystone.

C, immagini di segnale rappresentative GCaMP6f per pannelli superiori in-vivo e preparazioni di pannelli inferiori ex-vivo. I campioni non affamati vengono visualizzati a sinistra e i campioni affamati vengono visualizzati a destra. La figura tre illustra le misure di fluorescenza GCaMP6f.

A, il pannello in alto a sinistra mostra una mappa termica che mostra la dinamica temporale media dei segnali di calcio provenienti da elementi chiave di larve non affamate, N=5, e affamate, N=5, nella preparazione in vivo di larve intere. Il box plot nel pannello in alto a destra confronta l'intensità del segnale di calcio normalizzato tra i campioni non affamati in grigio e quelli affamati in bianco nella preparazione in vivo. Test U di Mann-Whitney, P è inferiore a 0,001.

B, il pannello in basso a sinistra mostra una mappa di calore che mostra la dinamica media al portale dei segnali di calcio da Keystone LN da non-affamati, N=5 e affamati N=5 nel cervello sezionato ex-vivo della preparazione. Il box plot nel pannello in basso a destra confronta l'intensità del segnale di calcio normalizzato tra campioni non affamati, grigi, e affamati, bianchi, nella preparazione ex-vivo. Il test U di Mann-Whitney B è inferiore a 0,001.

Per dimostrare il nostro approccio di imaging larvale del calcio, lo abbiamo applicato con successo sia a preparazioni in-vivo che ex-vivo delle larve di Drosophila. In entrambe le preparazioni, abbiamo osservato una maggiore attività chiave del LN e campioni affamati rispetto ai campioni non affamati. Questa maggiore attività trapezoidale è stata chiaramente osservata nelle mappe di calore, che mostrano rappresentazioni temporali delle risposte nell'arco di 60 secondi, e nei box plot che raffigurano i valori medi di intensità del segnale.

Questi risultati sono coerenti con gli studi recenti che dimostrano una maggiore attività dei neuroni olfattivi negli animali affamati. Come dimostrato in questo video, l'adesivo tissutale GLUture riduce significativamente gli artefatti da movimento sia nelle configurazioni in-vivo che ex-vivo. Questo metodo potrebbe essere applicato anche per studiare diversi tipi di stimoli, ad esempio l'applicazione esterna di odori e la superfusione interna di neuromodulatori.