Valutazione della Sicurezza Microbica dei Caseifici mediante Profilazione Proteomica Batterica tramite Approccio MALDI

Abbiamo sviluppato un protocollo per preparare e isolare le comunità microbiche da vari prodotti quotidiani, come latte, panna, burro e formaggio. Una volta isolato, questo microrganismo può essere identificato rapidamente e con precisione utilizzando la MALDI-TOF MS. Ottimizzare le condizioni di coltura rimane una sfida chiave, insieme a lacune nel database e all'impegnativa estrazione di batteri gram-positivi e formatori di spore. Per cominciare, prendi un campione rappresentativo del prodotto lattiero-caseario e mescola accuratamente per garantirne l'uniformità.

Asepticamente, trasferire un millilitro o un grammo di campioni solidi in un tubo centrifuga conico da 15 millilitri contenente nove millilitri di mezzo liquido sterile. Vortice vigorosamente il tubo per 30-60 secondi per omogeneizzare il campione. Successivamente, si prepara una serie di diluizioni dieci volte più volte trasferindo un millilitro della sospensione omogenea in tubi successivi, ciascuno contenente nove millilitri di soluzione sterile.

Mescola ogni diluizione accuratamente tramite vortice o scuoti. Poi, si prelevano 0,1 millilitri del campione originale, o di una delle diluizioni preparate, e trasferitelo sulla superficie di una piastra di Petri preparata contenente il materiale agar appropriato. Utilizzando uno spreader sterile, distribuire uniformemente l'inoculo sulla superficie della piastra di agar.

Per l'incubazione aerobica, inoculare le placche agar APT, M17, CBL, MPCA e TSA con i campioni preparati. Incubare le placche in condizioni aerobiche a 37 gradi Celsius e 30 gradi Celsius per 24 ore. Per l'incubazione anaerobica, posizionare le placche agar di MRS inoculate in una camera anaerobica e incubare a 37 gradi Celsius e 30 gradi Celsius per 24-72 ore.

Rimuovi le piastre dall'incubatrice ed esaminale quotidianamente per monitorare la crescita microbica. Utilizzando un anello microbico di un microlitro, striatura le colonie selezionate sullo stesso mezzo agar per sottocolturarle. Incubare nelle stesse condizioni usate in precedenza.

Per l'analisi della spettrometria di massa, si inizia preparando la soluzione della matrice MALDI. Prepara la miscela di solventi usando il 50% di acetonitrile, acqua HPLC al 47,5% e acido tricloroacetico al 2,5%. Dissolvere il composto della matrice nella miscela solvente fino a una concentrazione finale di circa 10 milligrammi per millilitro.

Per l'identificazione dei batteri tramite la SM utilizzando il metodo di trasferimento diretto della colonia, si utilizza un anello sterile per trasferire un microlitro di una colonia batterica cresciuta su un punto sulla piastra bersaglio di MALDI. Distribuisci il materiale batterico per creare uno strato sottile e uniforme sulla piastra del piatto. Una volta essiccato, aggiungi un microlitro di soluzione a matrice HCCA sopra e lascia asciugare all'aria a temperatura ambiente.

Per il metodo di estrazione dell'acido formico a bersaglio, si utilizza un anello microbico usa e getta o uno stuzzicadenti sterile per prelevare una piccola quantità di biomassa batterica da una singola colonia. Spalma il materiale direttamente su un punto della piastra bersaglio MALDI per creare uno strato sottile e uniforme. Aggiungi un microlitro di soluzione al 70% di acido formico sull'area spalmata.

Una volta che la macchia si è asciugata, sovrapporla con un microlitro di soluzione a matrice HCCA e lasciala asciugare all'aria a temperatura ambiente. Per il metodo di estrazione proteica in tubo, si trasferisce da una a tre colonie complete da una piastra di coltura agar in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 300 microlitri di acqua sterile. Aggiungi 900 microlitri di etanolo assoluto per ottenere una concentrazione finale di circa il 75%. Dopo aver miscelato brevemente il contenuto, centrifuga il tubo per due minuti a 15.000 g a temperatura ambiente.

Successivamente, scartare con cura il soprantantante senza disturbare la pellet cellulare. Poi aggiungi da 20 a 50 microlitri di acido formico al 70% al pellet di cellule essiccate. Mescola il contenuto tramite pipetazione o vortex finché il pellet non è completamente sospeso.

Ora, aggiungi un volume uguale di acetonitrile alla sospensione dell'acido formico e mescola accuratamente. Centrifuga il tubo a 15.000 g per due minuti. Trasferire un microlitro del sovrantato risultante in un punto designato su una piastra bersaglio MALDI e lasciarlo asciugare.

Poi, sovrappone la macchia secca con un microlitro di soluzione a matrice HCCA. Pipetta un microlitro o dello standard batterico contenente un estratto di Escherichia coli DH5 alpha o del calibratore microbiologico contenente estratto proteico E.coli ATCC 25922, ribonucleasi e mioglobina. Per l'acquisizione degli spettri e l'identificazione microbica, preparare i punti di calibrazione sulla piastra bersaglio MALDI.

Carica la piastra bersaglio MALDI sia con i punti campione preparati che con quelli calibranti nello strumento di spettrometria di massa. Esegui l'analisi di calibrazione in modalità calibrazione per calibrare il sistema. Azionare lo spettrometro di massa in modalità ionica positiva lineare per l'acquisizione generale degli spettri.

Successivamente, imposta il raggio di rilevamento di massa dello spettrometro di massa in modo che copra un rapporto massa-carica da 2.000 a 20.000. Acquisire spettri in duplicato per ogni punto per generare almeno quattro repliche tecniche per campione. Ora, applica il metodo Savitzky-Golay come algoritmo di smoothing.

Usa l'algoritmo TopHat per la correzione della linea di base e rimuovere il rumore di fondo. Poi, rileva i picchi usando la modalità centroide. Carica gli spettri di massa processati degli isolati batterici sconosciuti sulla piattaforma di identificazione microbica all'interno del software MALDI ed esegui l'identificazione.

Valuta i punteggi di identificazione secondo gli standard soglia del produttore. Gli spettri di spettrometria di massa mostravano profili proteici specifici per specie, permettendo l'identificazione a livello di genere o specie. Il dendrogramma ha rivelato un'elevata somiglianza osservata tra ceppi della stessa specie e una chiara differenziazione tra specie.

Un tempo di incubazione più breve di 12 ore per Bacillus licheniformis ha prodotto un valore di punteggio DI più alto di 2,38, mentre un'incubazione più lunga di 18-24 ore ha portato a un valore di punteggio ID più basso di 1,85 a causa della predominanza dei segnali delle spore. Tra i metodi di preparazione del campione, l'estrazione proteica in tubo ha dato il punteggio ID più alto di 2,23, seguita dall'estrazione di acido formico nel bersaglio a 1,97, e dal trasferimento diretto della colonia, che ha portato al punteggio più basso di 1,61. Combinando la culturomica con la preparazione del campione su misura, MALDI consente un'analisi del microbioma più precisa e veloce a costi inferiori, producendo risultati paragonabili ai metodi di riferimento 16S rRNA.

Questo protocollo consente un monitoraggio di routine ad alta produttività dei microrganismi nei prodotti lattiero-caseari, migliorando la velocità e la precisione di rilevamento e rafforzando infine i sistemi di qualità e sicurezza alimentare. L'espansione dei database MALDI e l'automatizzazione dei flussi di lavoro nei laboratori industriali miglioreranno l'identificazione microbica, aumenteranno la capacità produttiva, ridurranno gli errori e accelereranno il monitoraggio del microbiota.