Name: Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Scopri protocolli ottimizzati per la preparazione di campioni in metabolomica a singola cellula mediante spettrometria di massa. Questo metodo utilizza lavaggio, tempra con azoto liquido e essiccazione per preservare i profili metabolici cellulari.

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<table><tbody><tr><td>-80 &deg; C congelatore</td><td>Eppendorf Nuovo Brunswick</td><td>U700</td><td>Preparazione del campione </td></tr><tr><td>Acetontrile</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>240744</td><td>Configurazione dell'esperimento SCMS</td></tr><tr><td>Formiato di ammonio </td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>401152500</td><td>Preparazione del campione </td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti 18 mm</td><td>Vetro di copertura micro VMR</td><td>48380046</td><td>Coltura cellulare </td></tr><tr><td>Stereomicroscopio digitale</td><td>Shenzhen D & F Co.</td><td>Supereyes T004</td><td>Analisi</td></tr><tr><td>Tubo in quarzo a doppio foro, 1,120 "x0,005" x12 "</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc.</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td>Fabbricazione a sonda singola</td></tr><tr><td>Resina epossidica</td><td>Devcon</td><td>Codice-No 20945</td><td>Fabbricazione a sonda singola</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>La scienza di Ward </td><td>470301-120 500mL</td><td>Configurazione dell'esperimento SCMS</td></tr><tr><td>Capillare in silice fusa, ID: 40 &micro; m, OD: 100 &micro; m</td><td>Tecnologie Polymicro</td><td>TSP040105</td><td>Fabbricazione a sonda singola</td></tr><tr><td>Capillare in silice fusa, ID: 50 &micro; m, OD: 150 &micro; m</td><td>Tecnologie Polymicro</td><td>1068150015</td><td>Configurazione dell'esperimento SCMS</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, 18mm</td><td>VWR </td><td>48380046</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>HyClone Siero sintetico (FBS)</td><td>Clone</td><td>SH3006603</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Incubatrice </td><td>HeraCell (Heraeus)</td><td></td><td>Coltura cellulare </td></tr><tr><td>Estrattore laser</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modello P-2000</td><td>Fabbricazione a sonda singola</td></tr><tr><td>Lampada UV a LED</td><td>Attrezzatura dentale Foshan Liang Ya</td><td>LY-C240</td><td>Fabbricazione a sonda singola</td></tr><tr><td>5A di McCoy </td><td>Gibco </td><td>2537128</td><td>Coltura cellulare </td></tr><tr><td>Microunione</td><td>IDEX Salute & Scienza LLC</td><td>M-539</td><td>Configurazione dell'esperimento SCMS</td></tr><tr><td>Interfaccia FAIMS pro modificata </td><td>Thermo Fisher </td><td>98100-20046</td><td>Analisi </td></tr><tr><td>Kit di rilevamento del micoplasma MycoAlert PLUS</td><td>Lonza</td><td>LT07-703</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Scheda ottica </td><td>Thorlabs Inc., Newton</td><td></td><td>Analisi </td></tr><tr><td>Acqua di grado LC/MS Optima (Fisher Chemical, USA)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>W6500</td><td>Preparazione del campione </td></tr><tr><td>Spettrometro di massa Orbitrap Exploris 240 </td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td></td><td>Configurazione dell'esperimento SCMS</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>VWR</td><td>0780-50L</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Concentratore SpeedVac (Savant)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td> SPD111 V</td><td>Preparazione del campione </td></tr><tr><td>Pompa a siringa (SKE10)</td><td>Chemyx Inc.</td><td>80561</td><td>Configurazione dell'esperimento SCMS</td></tr><tr><td>Siringa, 250 &; micro; L</td><td>Hamilton</td><td>1725LTN250UL</td><td>Configurazione dell'esperimento SCMS</td></tr><tr><td>TC20 Contatore di celle automatizzato</td><td>Laboratori Bio-Rad </td><td>Codice 1450102EDU</td><td>Conteggio delle celle</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale, 100 mm</td><td>Fisher scientifico </td><td>FB012924</td><td>Coltura cellulare </td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>25200-072</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Microscopio digitale USB ("Scorpio" 500 Zoom)</td><td>Chinavasion, Commercio all'ingrosso Ltd.</td><td></td><td>Analisi </td></tr><tr><td>Resina a polimerizzazione UV</td><td>Prime Dentale</td><td>N. articolo 006.030</td><td>Fabbricazione a sonda singola</td></tr><tr><td>Software Xcalibur</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stadio XYZ (CONEX- MFACC)</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td>Analisi </td></tr></tbody></table>

preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Sample Preparation for Single Cell Mass Spectrometry Metabolomics Studies: Combined Cell Washing, Quenching, Drying, and Storage

Questo rapporto descrive una metodologia che integra il lavaggio cellulare, la tempra rapida delle celle, l'essiccazione sotto vuoto e lo stoccaggio a -80 °C (Figura 1). In particolare, questo approccio è progettato per preservare lo stato metabolomico delle cellule prima dell'analisi SCMS. L'efficacia di questo protocollo è stata testata preparando le cellule in due diverse condizioni: cellule appena temprate ed essiccate (Gruppo 1, che funge da controllo) e cellule temprate, essiccate e conservate a -80 °C (Gruppo 2). Ogni gruppo è stato analizzato utilizzando il metodo SCMS a sonda singola sia in modalità ionica positiva che negativa. L'analisi delle componenti principali (PCA) e la visualizzazione della mappa di calore sono state utilizzate per valutare le differenze nei profili metabolomici tra i gruppi.
I risultati della PCA nella modalità ionica positiva (Figura 2A) hanno rivelato che i gruppi 1 e 2 avevano profili metaboliti complessivi simili. I profili quasi identici del Gruppo 1 e del Gruppo 2 dimostrano che la conservazione a -80 °C per 48 ore non altera significativamente il metaboloma se le cellule vengono adeguatamente estinte prima dell'essiccazione. Nella modalità ionica negativa (Figura 2B), si osserva un modello comparabile, sebbene il Gruppo 2 appaia leggermente più distinto, potenzialmente a causa delle differenze di ionizzazione tra specifiche classi di metaboliti, ad esempio, le fosfatidilcoline sono meglio rilevate in modalità positiva, mentre gli acidi grassi ionizzano in modo più efficiente in modalità negativa60. Nonostante questa variazione, il raggruppamento coerente tra i gruppi 1 e 2 in entrambe le modalità supporta la conclusione che il protocollo integrato di quenching-drying-storage mantiene l'integrità metabolica.
L'analisi della mappa di calore ha ulteriormente convalidato i risultati della PCA raffigurando le abbondanze relative dei primi 100 metaboliti in due gruppi. Come mostrato nella Figura 3, i primi 100 metaboliti mostrano modelli di abbondanza altamente coerenti tra il Gruppo 1 e il Gruppo 2 in entrambe le modalità ioniche. Non sono stati osservati cambiamenti importanti o raggruppamenti specifici del gruppo, sebbene variazioni minori in alcuni cluster di metaboliti possano riflettere differenze nell'efficienza di ionizzazione o nella stabilità dei metaboliti. Questi risultati dimostrano collettivamente che il flusso di lavoro quenching-drying-storage preserva i profili metabolomici cellulari con alta fedeltà, rendendolo adatto per le applicazioni SCMS ambientali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig1.jpg"> 
Figura 1: Flusso di lavoro generale per l'analisi della spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) che indaga su come il quenching di LN2 e la conservazione di 48 ore a -80 °C influenzino i profili dei metaboliti nelle singole cellule. (A) Le cellule sono state seminate, incubate e risciacquate utilizzando una soluzione di formato ammonio (AF). (B) Sono stati preparati due gruppi di cellule: Gruppo 1: le cellule sono state lavate, spente e liofilizzate per esperimenti SCMS immediati senza conservazione; Gruppo 2: le celle sono state lavate, temprate, liofilizzate e conservate a -80 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig2.jpg"> 
Figura 2: Analisi delle componenti principali (PCA) dei dati SCMS da cellule HCT-116 in gruppi sperimentali in (A) modalità ioni positivi e (B) modalità ioni negativi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig3.jpg"> 
Figura 3: Mappe di calore che mostrano i livelli relativi dei primi 100 metaboliti rilevati in singole cellule HCT-116 preparate in varie condizioni, presentate per (A) modalità di ioni positivi e (B) modalità di ioni negativi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Single-cell mass spectrometry (SCMS) has become an indispensable tool for studying cellular metabolism. Owing to advancements in modern mass spectrometry ...

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