Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Abbiamo sviluppato protocolli per preservare l'integrità dei metaboliti cellulari per studi di spettrometria di massa a singola cellula. Abbiamo studiato come le condizioni di lavaggio, quenching e conservazione influenzano i metaboliti cellulari. Recentemente sono stati sviluppati nuovi metodi di preparazione dei campioni e tecniche di spettrometria di massa per far progredire gli studi di metabolomica a singola cellula e comprendere meglio l'eterogeneità cellulare e i meccanismi della malattia.

I ricercatori devono superare molteplici sfide chiave, tra cui la quantità limitata di campioni, la ridotta sensibilità di rilevamento a causa della complessità del campione e l'alterazione dei metaboliti a causa della preparazione e dell'analisi del campione. Dimostriamo tecniche complete di preparazione dei campioni in grado di preservare i metaboliti cellulari e l'integrità cellulare per studi metabolomici di spettrometria di massa a singola cellula. I nostri protocolli potrebbero offrire un modo semplice ed efficace per la preparazione, la conservazione e il trasporto di campioni per studi metabolomici su singola cellula utilizzando diverse tecniche di spettrometria di massa.

Per iniziare, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica. Monitora quotidianamente la confluenza delle cellule e fai il loro passaggio quando le colture raggiungono l'80% di confluenza. Per il passaggio, aspirare il terreno dal piatto e sciacquare una volta con cinque millilitri di PBS.

Incubare le cellule con due millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% a 37 gradi Celsius per tre minuti per facilitare il distacco delle cellule. Neutralizzare la tripsina aggiungendo otto millilitri di terreno completo di preriscaldamento e pipettare delicatamente per disperdere le cellule. Trasferire un millilitro di sospensione in nove millilitri di terreno fresco e completo per contare le cellule.

Per seminare le cellule, diluirle a una concentrazione finale di una volta 10 alla potenza di sei cellule per millilitro. Posizionare i singoli vetrini di vetro da 18 millimetri nei pozzetti di una piastra da 12 pozzetti. Aggiungere due millilitri di terreno completo e 200 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto per ottenere due volte 10 alla potenza di cinque cellule per pozzetto.

Incubare le cellule durante la notte per consentire l'adesione. Per il lavaggio delle cellule, aggiungere due millilitri di soluzione fredda di formiato di ammonio a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Quindi, utilizzando una pinza sterile, sollevare delicatamente ciascun vetrino coprioggetto contenente le cellule di aderenza dal suo pozzetto e posizionarlo brevemente per due o tre secondi in un pozzetto separato preriempito con due millilitri di soluzione fredda di formiato di ammonio allo 0,9%.

Posizionare ogni vetrino coprioggetto risciacquato con formiato di ammonio con le celle rivolte verso l'alto in una capsula di Petri all'interno di un contenitore di alluminio. Versare lentamente da 10 a 20 millilitri di azoto liquido sui vetrini coprioggetti per garantire una copertura completa. E inclinare immediatamente la capsula di Petri con una pinzetta per decantare l'azoto liquido rimanente.

Utilizzando guanti criogenici e pinzette isolanti, posizionare la capsula di Petri contenente i vetrini del coperchio di raffreddamento dell'azoto liquido nella camera del concentratore a vuoto. Processare i campioni utilizzando le impostazioni standard del vuoto per cinque-sette minuti fino a quando l'azoto liquido visibile evapora e i vetrini coprioggetti appaiono asciutti. Assicurarsi che i vetrini coprioggetti asciutti non contengano residui di azoto liquido o cristalli di ghiaccio.

Quindi, avvolgi il contenitore con un tovagliolo di carta e trasferiscilo in un congelatore a 80 gradi Celsius per 48 ore. Dopo la conservazione, trasferire i vetrini di copertura contenenti la capsula di Petri in un essiccato a temperatura ambiente per 10 minuti. Assicurarsi che la brina condensata o l'acqua sui vetrini coprioggetti scompaiano completamente prima di rimuoverli dall'essiccatore.

Dividere i campioni in due gruppi e trattarli in modo appropriato. A questo punto, montare la singola sonda sullo stadio XYZ e fissarla a un manipolatore XYZ motorizzato posizionato sotto un microscopio digitale. Accoppia la configurazione a sonda singola a uno spettrometro di massa per l'analisi SCMS.

Utilizzare acetone nitrile contenente lo 0,1% di acido formico a una purezza di almeno il 99,9% come solvente di estrazione e somministrarlo a una velocità di flusso di 150 nanolitri al minuto utilizzando una pompa a siringa. Impostare i parametri della spettrometria di massa per le modalità di ioni positivi e negativi. A questo punto, posizionare i due vetrini coprioggetto del primo e del secondo gruppo sul tavolino XYZ motorizzato della configurazione SCMS a sonda singola e utilizzare il microscopio per selezionare casualmente le cellule per l'analisi.

Dopo aver acquisito gli spettri di massa, analizzare circa 30 cellule per gruppo utilizzando la stessa singola sonda, la stessa velocità di flusso del solvente e la stessa tensione di ionizzazione. I dati SCMS grezzi sono stati pre-elaborati utilizzando uno script R personalizzato e applicando la rimozione dello sfondo e del rumore seguita dalla normalizzazione dell'intensità ionica alla corrente ionica totale. Deisotopo i dati SCMS utilizzando il pacchetto Python MSD isotopico.

Esegui l'allineamento dei picchi utilizzando uno script Python interno. Applicare una larghezza del contenitore di 0,01 rapporto di carica principale per il binning e una tolleranza di massa di 0,01 rapporto di carica principale o cinque parti per milione per l'allineamento dei picchi. Esecuzione di analisi statistiche dei dati con Metabo Analyst 6.0.

Eseguire un test T e generare una mappa di calore che mostri i livelli relativi di metaboliti. Seleziona l'opzione utilizzata top 100 e T-test o Inova per generare i primi 100 metaboliti classificati per significatività e tracciare una mappa di calore utilizzando questi primi 100 metaboliti con differenze significative. Infine, cercare i valori accurati della carica principale rispetto al database del metaboloma umano utilizzando una tolleranza di massa di 10 parti per milione per la ricerca nel database.

L'analisi delle componenti principali nella modalità ionica positiva ha mostrato che il gruppo uno e il gruppo due si sovrapponevano strettamente, indicando profili di metaboliti molto simili. Nella modalità a ioni negativi, è stato osservato un modello comparabile, sebbene il secondo gruppo apparisse leggermente più distinto. L'analisi della mappa di calore dei primi 100 metaboliti ha mostrato modelli di abbondanza altamente coerenti tra il primo e il secondo gruppo in entrambe le modalità ioniche.

Non sono stati osservati cambiamenti importanti o raggruppamenti specifici del gruppo. Sebbene variazioni minori in alcuni cluster di metaboliti possano riflettere differenze nell'efficienza di ionizzazione o nella stabilità dei metaboliti.