Induzione di precisione e distinzione dei riflessi di tosse e starnuti nei topi

Questo protocollo si concentra sul riflesso respiratorio nei topi. Miriamo a stimolare la trachea e la cavità nasale per indurre tosse e starnuti, e questo differenzierà questi due tipi di eventi in base alle caratteristiche audio. Studi precedenti hanno spesso utilizzato capsaicina nebulizzata o acido citrico per stimolare il controllo respiratorio e i comportamenti di tosse e starnuti nei topi.

Tuttavia, non è chiaro se la stimolazione respiratoria tramite nebulizzazione induca tosse, starnuti o entrambi, poiché attualmente non esiste un metodo affidabile per distinguere queste due risposte. Per questo progetto, abbiamo stabilito un metodo per indurre tosse e starnuti stimolando selettivamente la trachea o la cavità nasale. Abbiamo inoltre utilizzato l'analisi acustica per identificare le caratteristiche distintive tra tosse e starnuto.

La nostra ricerca in massa fornisce uno strumento potente che supporterà direttamente lo sviluppo di futuri farmaci per i disturbi della tosse e degli starnuti. Per cominciare, taglia un ago calibro 28 in una cannula lunga circa cinque millimetri. Usando pinze e carta abrasiva, leviga entrambe le estremità e fissa un'estremità a un tubo in silicone.

Collega la cannula collegata a tubo a una siringa da un millilitro e risciacqua la cannula con acqua per verificarne la permeabilità. Successivamente, piega la cannula a un angolo di 90 gradi con un rapporto di due a tre bracci. Inserisci il braccio più lungo nel tubo in silicone lungo cinque centimetri.

Assegnare casualmente i topi a tre gruppi, con sei topi ciascuno. Ora, fissa il topo anestetizzato in posizione supina sul tavolo. Dopo aver rasato i peli cranici e cervicali, disinfettare l'area con iodoforo e alcol.

Al microscopio, incisi la pelle cervicale per circa un centimetro e seziona in modo intratto tessuti e muscoli per esporre la trachea. Perforare i tessuti molli tra le cartilagini cricoide e tracheale usando un ago calibro 32. Poi, crea una minima apertura tracheale con forbici oftalmiche.

Inserire la cannula metallica rivestita in silicone per circa un millimetro nel lumen tracheale e fissare la giunzione canula-trachea con una sutura 7-0. Ora, incisi il cuoio capelluto per circa un centimetro e scava in modo sbagliato sottocutaneamente dal collo fino al cranio. Fai passare il tubo in silicone attraverso il tunnel sottocutaneo fino al cranio, fissalo sul cranio usando cemento dentale, poi cuci la pelle.

Sutura l'incisione cervicale e lascia che l'animale si riprenda per cinque giorni. Montare la sonda ultrasonica con un anello di sigillatura compatibile con la porta e inserire la sonda nella porta della camera di pletismografia per tutto il corpo per garantire un contatto ermetico. Collega la camera di pletismografia a tutto il corpo al sensore di flusso e al sistema di flusso di polarizzazione.

Attacca un tubo in silicone fissato al cranio a un tubo di estensione da 30 centimetri e posiziona il mouse nella camera di pletismografia per tutto il corpo. Estendi il tubo attraverso la porta superiore della camera e sigilla il tubo usando argilla da modellare attorno al tubo. Verifica l'ermeticità confermando che i picchi della forma d'onda respiratoria cadano entro quattro, più o meno due.

Collega una siringa da un millilitro caricata con cinque millilitri di soluzione di capsaicina al tubo di estensione e montala sulla pompa di microiniezione. Posiziona una telecamera ad alta velocità rivolta verso la camera. Regola la distanza e la messa a fuoco della fotocamera per una visuale chiara e imposta la frequenza di campionamento a 160 fotogrammi al secondo.

Ora, avvia contemporaneamente la pletismografia per tutto il corpo, l'ecografia e il software della fotocamera. Attiva la pompa per iniziare l'infusione di capsaicina e registra i conteggi della tosse per 10 minuti. Prepara gli animali e tutti i materiali necessari per la procedura.

Dopo aver anestetizzato e preparato il mouse, fissalo in un telaio stereotassico. Disinfetta l'area chirurgica con iodoforo e alcol. Incisci la pelle sopra il cranio e l'osso nasale, usando un bisturi per esporre l'osso nasale.

Utilizzando un microtrapano, crea un foro di 0,5 millimetri alla giunzione tra l'osso nasale e il processo laterale della cartilagine nasale settale. Ora, espone la mucosa nasale attraverso il foro della bava. Solleva delicatamente la mucosa nasale usando un ago calibro 32 per esporre la cavità nasale.

Poi, monta il tubo di polietilene nel braccio stereotassico. Allinea la punta del tubo a filo con l'apertura del foro della bava, fissa il tubo all'osso nasale usando cemento dentale, quindi cuci la pelle. Metti il mouse su una base termica e lascialo riprendersi finché non torna cosciente.

Collega la camera di pletismografia a corpo intero al sensore di flusso e al sistema di flusso di polarizzazione secondo il manuale del produttore. Successivamente, monta la sonda ultrasonica con una guarnizione adattata alla porta. Inserisci la sonda nella camera della pletismografia e verifica una guarnizione ermetica.

Trasferire il mouse nella camera della pletismografia e estendere il tubo di polietilene attraverso la porta superiore. Sigilla la porta usando argilla da modellare per fissare il tubo. Verifica l'ermeticità della camera e posiziona la fotocamera come mostrato prima.

Infine, avanzare un filamento di nylon di 0,25 millimetri di diametro attraverso un tubo morbido nella cavità nasale fino a una profondità da zero a tre millimetri. Lascia esposti cinque centimetri del filamento oltre il tubo portatile. Durante ogni stimolazione, premere l'estremità libera del filamento finché non si piega a circa 45 gradi, fornendo circa 0,6 grammi di forza alla mucosa nasale per un secondo.

Ripeti la stimolazione una volta ogni 30 secondi mentre registri le risposte agli starnuti per 10 minuti. I topi sottoposti a chirurgia tracheale o nasale con stimolazione nasale meccanica e sfida tracheale con capsaicina hanno aumentato significativamente gli eventi di starnuto e tosse, rispettivamente. Le registrazioni della pletismografia a tutto il corpo hanno mostrato sia tracce respiratorie singole che doppie di picco per tosse indotta da capsaicina e starnuti indotti meccanicamente.

Gli oscillogrammi sonori hanno rivelato che l'audio della tosse aveva un picco di intensità improvviso all'inizio, concentrato nell'intervallo da zero a 30 kilohertz. Mentre l'audio starnuto cresceva progressivamente in intensità, copriva un intervallo da zero a 80 kilohertz e aveva una durata più lunga. La fase di compressione delle tossi a picco singolo è stata in media di circa 32,39 millisecondi, significativamente più breve rispetto alle tosse a doppio picco, intorno ai 53,17 millisecondi.

La fase media di compressione degli starnuti a singolo picco era di circa 44,03 millisecondi, mentre quelli a doppio picco erano in media di circa 74,24 millisecondi e significativamente più lunghi. I modelli di picco singolo si sono verificati nel 77,55% delle tosse, mentre solo il 32,42% degli starnuti ha mostrato picchi singoli, con schemi di doppio picco dominanti al 67,58%. Le durate audio degli starnuti sono state significativamente più lunghe rispetto a quelle della tosse, sebbene con intervalli sovrapposti. La transezione degli afferenti sensoriali nasali ha ridotto significativamente gli starnuti indotti dalla capsaicina, mentre la tosse è rimasta intatta.