Name: Actina Co-sedimentazione di analisi, per lAnalisi del Binding Protein a F-Actina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri l'assay di co-sedimentazione dell'actina per analizzare le interazioni proteiche con l'F-actina in vitro. Questo metodo biochimico permette di studiare il citoscheletro dinamico nelle cellule.

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Grazie al Dr. Praveen Kumar in laboratorio Wittman presso UCSF per il film di actina in cellule HaCaT.

1. Preparazione di actina La fonte di actina utilizzati in questo test è stato piastrine umane non-muscolare (β-actina) ottenuto dal citoscheletro Inc. aliquote di Borsa di 10 sono tenute mg / ml nel congelatore -70 ° C. Per l&#39;analisi, l&#39;actina è diluito a 0,4 mg / ml in un tampone contenente 5 mM Tris pH 8, 0.2 mm CaCl 2, 0,2 mM ATP e 0,5 mM DTT, centrifugato a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Il surnatante, che è actina monomerica è pronto per essere polimerizzato. Polimerizzazione di actina è indotta con l&#39;aggiunta 50 mM KCl, 1 mM ATP e 2 mM MgCl 2. La polimerizzazione avviene a temperatura ambiente per 1 ora. 2. La preparazione di proteine In questo saggio, stiamo usando il C-terminale della Talin, che è stato purificato come GST-tag delle proteine. Le proteine ​​da utilizzare nel saggio è sottoposto ad una centrifugazione ad alta velocità di pre-clear di aggregati prima dell&#39;incubazione con F-actina. La proteina è filata a 100.000 g in un ultracentrifuga Beckman per 20 minuti a 22 º C. 3. Actina-proteina incubazione La quantità di actina e proteine ​​in un test possono variare. In questo esempio stiamo usando actina in eccesso. Normalmente, un rapporto molare è calcolato, ad es. uno rapporto 4:1 molare di actina alle proteine. Nel saggio successivo, il volume finale di reazione è di 150 microlitri. Il buffer in cui vengono incubate le proteine ​​e F-actina dipenderà la proteina da testare e le condizioni richieste. In questo esempio, utilizziamo un tampone contenente 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 e 2 mM MgCl 2. La proteina e F-actina sono incubati in tampone per 1 ora a temperatura ambiente. 4. Sedimentazione di F-actina Dopo l&#39;incubazione, i campioni sono filata a 100.000 g a 22 ° C. Usiamo un ultracentrifuga Beckman nel video. Il rotore viene accuratamente rimossa in modo da non disturbare il pellet. 5. Analisi di proteine ​​co-sedimentazione con F-actina I surnatanti sono accuratamente rimosse pipettando in una provetta Eppendorf e 5 X Laemmli SDS-PAGE tampone campione viene aggiunto. Un volume adeguato di 1 X Laemmli SDS-PAGE tampone campione viene aggiunto al pellet rimanenti, pipettati su e giù, e trasferiti a nuovi tubi eppendorf. Le quantità relative di proteine ​​nel pellet e surnatanti vengono analizzati in seguito alla loro separazione mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie blu del gel o Western blotting. Al fine di determinare la specificità di interazione con la proteina actina, l&#39;actina concentrazione-dipendente co-sedimentazioni possono essere eseguite. Per questo tipo di esperimento, un importo fisso della proteina e una serie di quantità crescenti di actina sono incubati, e l&#39;analisi è eseguita come sopra descritto.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Actina co-sedimentazione è un semplice test in vitro per analizzare le proteine ​​specfic vincolante a F-actina. In questo video, si dimostra un esempio di come un semplice co-actina sedimentazione può essere effettuata. Mostriamo come preparare F-actina, preparare la proteina da testare e la procedura di actina co-sedimentazione. Un certo numero di punti dovrebbero essere considerati durante lo svolgimento actina co-sedimentazione saggi. Per esempio, i componenti del buffer per l&#39;incubazione può variare a seconda della proteina da test...

actina co-sedimentazione di analisi, per l&#39;analisi del binding protein a f-actina

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Il citoscheletro di actina all&#39;interno della cellula è una rete di filamenti di actina, che permette il movimento delle cellule e dei processi cellulari, e che genera tensione e aiuta a mantenere la forma cellulare. Anche se il citoscheletro è una struttura rigida, è una struttura dinamica che viene costantemente rimodellamento. Un certo numero di proteine ​​possono legarsi al citoscheletro di actina. Il legame di una proteina particolare a F-actina è spesso desiderato supporto di cellule osservazioni biologiche o per capire meglio i processi dinamici dovuti al rimodellamento del citoscheletro di actina. Il co-sedimentazione actina test è un test in vitro solitamente usata per analizzare il legame di specifiche proteine ​​o domini proteici con F-actina. I principi di base del test comportano una incubazione della proteina di interesse (a figura intera o di dominio), con F-actina, passo ultracentrifugazione a pellet F-actina e l&#39;analisi della proteina co-sedimentazione con F-actina. Actina co-sedimentazione test può essere progettato di conseguenza per misurare affinità di legame actina e nei saggi concorrenza.

Proteine ​​si legano l&#39;actina filamentosa (F-actina) attraverso i moduli di legame actina. In questo video ci dimostra la procedura di actina co-sedimentazione, che è un test in vitro solitamente usata per analizzare le proteine ​​o domini specifici che legano la F-actina.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

Il citoscheletro di actina all'interno della cellula è una rete di filamenti di actina che consente il movimento delle cellule e i processi cellulari, e che genera...

All'interno della cellula. Il citoscheletro di actina è una struttura dinamica, e il suo rimodellamento è importante in una varietà di processi, dalla divisione cellulare alla migrazione cellulare e al trasporto fisico. Un'ampia varietà di proteine può legarsi al citoscheletro di actina attraverso specifici moduli di legame all'actina.In questo video, illustriamo la procedura di co-sedimentazione con actina, un saggio in vitro comunemente utilizzato per analizzare proteine o domini specifici di proteine che si legano all'actina filamentosa. Salve, sono Jody Var del laboratorio della dottoressa Diane Barber presso il Dipartimento di Biologia delle Cellule e dei Tessuti dell'UCSF. In questo video vi mostrerò come eseguire un saggio di co-sedimentazione con actina.Questa procedura rappresenta un metodo per analizzare le proteine che si legano specificamente all'actina filamentosa e può essere utilizzata per misurare le affinità di legame. La procedura comprende i seguenti passaggi: formazione dei filamenti di actina e preparazione della proteina da testare, incubazione della proteina di interesse con l'actina filamentosa, o f-actina per brevità, centrifugazione ultracentrifuga dell'f-actina a centomila ×g per ottenere il pellet, e successiva analisi mediante elettroforesi SDS-PAGE e colorazione con Coomassie per visualizzare le frazioni del sopranatante e del pellet.E infine, l'analisi della proteina che co-sedimenta con l'actina F nella frazione del palato. Cominciamo. Per preparare i filamenti di actina, è buona pratica assicurarsi che l'actina con cui stiamo lavorando sia nella forma monomerica.Una soluzione stock di actina a 10 M per mil viene prelevata dal congelatore a meno 80 e viene preparata una diluizione di lavoro a 2,4 mg per mil in un buffer contenente tris cloruro di calcio, ATP per la stabilizzazione del monomero e DTT. La diluizione di lavoro viene posta sul ghiaccio per un'ora dopo un'incubazione di un'ora sul ghiaccio. La soluzione di actina viene centrifugata a 14.000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi.Il sopranatante risultante sarà l'actina monomerica. A partire da questi monomeri di actina purificati, ora è possibile generare actina filamentosa aggiungendo cloruro di potassio, cloruro di magnesio e ATP per un'ora. A temperatura ambiente, l'actina filamentosa è ora pronta per essere incubata con la proteina o il dominio proteico di interesse, come vi mostreremo nel prossimo passaggio.Per procedere con il saggio di co-sedimentazione dell'actina, dobbiamo preparare la proteina da testare. Oggi sto utilizzando il clan, che è stato purificato come proteina di fusione GSC. La proteina viene pre-purificata dagli aggregati mediante ultracentrifugazione e il sopranatante risultante è ora pronto per essere utilizzato nel saggio.Per verificare il legame della proteina all'actina, l'actina deve essere in eccesso. In questo caso, 10 microgrammi di actina vengono incubati con cinque microgrammi di proteina in un buffer contenente tris, ATP, BT, ME, captoetanolo, ETTA e cloruro di calcio, per ottenere un volume totale di 150 microlitri per l'incubazione proteina-actina. Le incubazioni vengono effettuate direttamente in provette per ultracentrifuga per un'ora a temperatura ambiente. Le provette uno e due rappresentano i controlli: la provetta uno contiene solo actina nel buffer.Due contiene solo proteina nel tubo tampone. Tre contiene sia actina che il CNU della tailina nel tampone due. Quattro è un controllo aggiuntivo per il legame non specifico, che contiene actina e proteina GST da sola. Dopo l'incubazione di un'ora, i nostri campioni vengono posizionati con attenzione nel rotore Beckman.Impostiamo quindi l'ultracentrifuga a centomila G ed eseguiamo la centrifugazione dei campioni per 20 minuti a 22 gradi C. Dopo questa centrifugazione, siamo in grado di preparare i nostri campioni per l'elettroforesi su gel SDS-PAGE. Dopo i 20 minuti di centrifugazione, i campioni vengono rimossi con attenzione dal rotore in modo da non disturbare il pellet. Viene fatta una marcatura sul lato del tubo in corrispondenza della posizione del pellet.Si presta attenzione nel trasferire il soprannatante in provette eppendorf alle quali viene aggiunto il buffer campione 5XSCS. Al pellet rimanente nelle provette dell'ultracentrifuga viene aggiunto il buffer campione 1XSCS. Dopo aver pipettato su e giù, il pellet sospeso viene trasferito in una nuova provetta eppendorf. I campioni vengono quindi bolliti in un blocco riscaldante per un massimo di 10 minuti. Dopo l'ebollizione, i campioni vengono caricati su un gel SDS-PAGE. In questo caso, sto utilizzando un gel al 10% già preparato.I campioni vengono caricati con attenzione nei pozzetti in ordine corretto. L'elettroforesi viene eseguita a volt costante per circa un'ora a temperatura ambiente. Al termine della corsa elettroforetica, il gel viene colorato con blu di Coomassie per visualizzare le proteine.Le soluzioni blu Kumasi devono coprire completamente il gel. Il gel viene lasciato in agitazione per almeno 20 minuti. Successivamente, la soluzione blu ESI viene rimossa e il gel viene immerso nella soluzione di detenzione.Il gel viene lasciato in agitazione per circa un'ora su un agitatore fino a quando le bande non risultano visibili nel gel. Dopo la colorazione con kumasi, il gel può essere analizzato per determinare la quantità relativa di proteina nelle frazioni di sopranata rispetto a quelle di pellet. Osservando il gel riparato nelle corsie uno e due, possiamo vedere le frazioni di sopranata e di pellet dell'acton da solo.Nelle corsie tre e quattro erano presenti le frazioni di sopernatante e pellet del solo C teer tailn. Nelle corsie cinque e sei erano presenti le frazioni di sopernatante e pellet dell'acton e del C di tail e dell'incubazione. Nelle corsie sette e otto erano presenti le frazioni di sopernatante e pellet dell'incubazione tra actina e la proteina GST.Come puoi vedere, la CT della coda è visibile solo nella frazione del palato nella corsia sei. I risultati di questa gel indicano un legame specifico del termine C, la coda, con l'actina. In questo video hai osservato come eseguire un saggio di co-sedimentazione con l'actina.Gli saggi di sedimentazione con Acton Co sono un metodo in vitro per analizzare le proteine leganti l'actina. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare questi punti. Precipitare in anticipo la proteina di interesse e includere un controllo negativo costituito dalla sola proteina per ogni incubazione proteina-actina.Questo controllo mostrerà se alcuna delle proteine pre-clarificate si deposita autonomamente, poiché il legame all'actina mediato da alcune proteine può essere sensibile al pH, alla temperatura o alla concentrazione di sale nel tampone. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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