Name: Actina Co-sedimentazione di analisi, per lAnalisi del Binding Protein a F-Actina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri l'assay di co-sedimentazione dell'actina per analizzare le interazioni proteiche con l'F-actina in vitro. Questo metodo biochimico permette di studiare il citoscheletro dinamico nelle cellule.

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Grazie al Dr. Praveen Kumar in laboratorio Wittman presso UCSF per il film di actina in cellule HaCaT.

1. Preparazione di actina La fonte di actina utilizzati in questo test è stato piastrine umane non-muscolare (β-actina) ottenuto dal citoscheletro Inc. aliquote di Borsa di 10 sono tenute mg / ml nel congelatore -70 ° C. Per l&#39;analisi, l&#39;actina è diluito a 0,4 mg / ml in un tampone contenente 5 mM Tris pH 8, 0.2 mm CaCl 2, 0,2 mM ATP e 0,5 mM DTT, centrifugato a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Il surnatante, che è actina monomerica è pronto per essere polimerizzato. Polimerizzazione di actina è indotta con l&#39;aggiunta 50 mM KCl, 1 mM ATP e 2 mM MgCl 2. La polimerizzazione avviene a temperatura ambiente per 1 ora. 2. La preparazione di proteine In questo saggio, stiamo usando il C-terminale della Talin, che è stato purificato come GST-tag delle proteine. Le proteine ​​da utilizzare nel saggio è sottoposto ad una centrifugazione ad alta velocità di pre-clear di aggregati prima dell&#39;incubazione con F-actina. La proteina è filata a 100.000 g in un ultracentrifuga Beckman per 20 minuti a 22 º C. 3. Actina-proteina incubazione La quantità di actina e proteine ​​in un test possono variare. In questo esempio stiamo usando actina in eccesso. Normalmente, un rapporto molare è calcolato, ad es. uno rapporto 4:1 molare di actina alle proteine. Nel saggio successivo, il volume finale di reazione è di 150 microlitri. Il buffer in cui vengono incubate le proteine ​​e F-actina dipenderà la proteina da testare e le condizioni richieste. In questo esempio, utilizziamo un tampone contenente 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 e 2 mM MgCl 2. La proteina e F-actina sono incubati in tampone per 1 ora a temperatura ambiente. 4. Sedimentazione di F-actina Dopo l&#39;incubazione, i campioni sono filata a 100.000 g a 22 ° C. Usiamo un ultracentrifuga Beckman nel video. Il rotore viene accuratamente rimossa in modo da non disturbare il pellet. 5. Analisi di proteine ​​co-sedimentazione con F-actina I surnatanti sono accuratamente rimosse pipettando in una provetta Eppendorf e 5 X Laemmli SDS-PAGE tampone campione viene aggiunto. Un volume adeguato di 1 X Laemmli SDS-PAGE tampone campione viene aggiunto al pellet rimanenti, pipettati su e giù, e trasferiti a nuovi tubi eppendorf. Le quantità relative di proteine ​​nel pellet e surnatanti vengono analizzati in seguito alla loro separazione mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie blu del gel o Western blotting. Al fine di determinare la specificità di interazione con la proteina actina, l&#39;actina concentrazione-dipendente co-sedimentazioni possono essere eseguite. Per questo tipo di esperimento, un importo fisso della proteina e una serie di quantità crescenti di actina sono incubati, e l&#39;analisi è eseguita come sopra descritto.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Actina co-sedimentazione è un semplice test in vitro per analizzare le proteine ​​specfic vincolante a F-actina. In questo video, si dimostra un esempio di come un semplice co-actina sedimentazione può essere effettuata. Mostriamo come preparare F-actina, preparare la proteina da testare e la procedura di actina co-sedimentazione. Un certo numero di punti dovrebbero essere considerati durante lo svolgimento actina co-sedimentazione saggi. Per esempio, i componenti del buffer per l&#39;incubazione può variare a seconda della proteina da test...

actina co-sedimentazione di analisi, per l&#39;analisi del binding protein a f-actina

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Il citoscheletro di actina all&#39;interno della cellula è una rete di filamenti di actina, che permette il movimento delle cellule e dei processi cellulari, e che genera tensione e aiuta a mantenere la forma cellulare. Anche se il citoscheletro è una struttura rigida, è una struttura dinamica che viene costantemente rimodellamento. Un certo numero di proteine ​​possono legarsi al citoscheletro di actina. Il legame di una proteina particolare a F-actina è spesso desiderato supporto di cellule osservazioni biologiche o per capire meglio i processi dinamici dovuti al rimodellamento del citoscheletro di actina. Il co-sedimentazione actina test è un test in vitro solitamente usata per analizzare il legame di specifiche proteine ​​o domini proteici con F-actina. I principi di base del test comportano una incubazione della proteina di interesse (a figura intera o di dominio), con F-actina, passo ultracentrifugazione a pellet F-actina e l&#39;analisi della proteina co-sedimentazione con F-actina. Actina co-sedimentazione test può essere progettato di conseguenza per misurare affinità di legame actina e nei saggi concorrenza.

Proteine ​​si legano l&#39;actina filamentosa (F-actina) attraverso i moduli di legame actina. In questo video ci dimostra la procedura di actina co-sedimentazione, che è un test in vitro solitamente usata per analizzare le proteine ​​o domini specifici che legano la F-actina.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

Il citoscheletro di actina all'interno della cellula è una rete di filamenti di actina che consente il movimento delle cellule e i processi cellulari, e che genera...

All'interno della cellula. Il citoscheletro di actina è una struttura dinamica, e il suo rimodellamento è importante in una varietà di processi, dalla divisione cellulare alla migrazione cellulare e al trasporto fisico. Un'ampia varietà di proteine può legarsi al citoscheletro di actina attraverso specifici moduli di legame all'actina.In questo video, illustriamo la procedura di co-sedimentazione con actina, un saggio in vitro comunemente utilizzato per analizzare proteine o domini specifici di proteine che si legano all'actina filamentosa. Salve, sono Jody Var del laboratorio della dottoressa Diane Barber presso il Dipartimento di Biologia delle Cellule e dei Tessuti dell'UCSF. In questo video vi mostrerò come eseguire un saggio di co-sedimentazione con actina.Questa procedura rappresenta un metodo per analizzare le proteine che si legano specificamente all'actina filamentosa e può essere utilizzata per misurare le affinità di legame. La procedura comprende i seguenti passaggi: formazione dei filamenti di actina e preparazione della proteina da testare, incubazione della proteina di interesse con l'actina filamentosa, o f-actina per brevità, centrifugazione ultracentrifuga dell'f-

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Noi applichiamo un'etichetta priva di analisi di interazioni proteina utilizzando X100 Biacore per la struttura-funzione di analisi del legame di mutanti diversi cistatina B di papaina attraverso la caratterizzazione cinetica. Calibrazione senza analisi concentrazione (ACCP) misura la concentrazione di proteine ​​con attività di legame mantenuto senza la necessità di una curva standard. Abbiamo dimostrato che la conferma delle concentrazioni utilizzando ACCP aumenta l'affidabilità delle analisi...

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

Polimerizzazione di FtsZ è essenziale per la divisione cellulare batterica. In questo rapporto, dettaglio semplici protocolli per monitorare l'attività di polimerizzazione FtsZ e discutere l'influenza della composizione del tampone. I protocolli possono essere usati per studiare l'interazione di FtsZ con proteine ​​regolatrici o farmaci antibatterici che influiscono FtsZ polimerizzazione.

FtsZ polimerizzazione saggi: protocolli semplici e considerazioni

Questo protocollo descrive un metodo per testare la capacità di una proteina a co-sedimentare con l'actina filamentosa (F-actina) e, se si osserva il legame, per misurare l'affinità dell'interazione.

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.

In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Per avanzare, i coni di crescita devono esercitare forze di trazione contro l'ambiente esterno. La generazione delle forze di trazione dipende dalla dinamica dell'actina e dall'accoppiamento della frizione. Il presente studio descrive i metodi per analizzare la dinamica dell'actina, l'accoppiamento della frizione e le forze di trazione per l'avanzamento del cono di crescita.

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Questo protocollo descrive la formazione di doppi strati lipidici supportati e l'aggiunta di filamenti citoscheletrici e proteine motorie per studiare la dinamica delle reti citoscheletriche ricostituite e legate alla membrana utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

Questo protocollo descrive come produrre comete di actina sulle superfici delle perle utilizzando ingredienti proteici disponibili in commercio. Tali sistemi imitano le strutture protrusive presenti nelle cellule e possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi fisiologici della produzione di forza in modo semplificato.

Ricostituzione della motilità a base di actina con proteine disponibili in commercio

Questo metodo descrive un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla lectina per quantificare l'affinità di legame della fosfatasi glucana e dell'amilopectina. Questo saggio di co-sedimentazione è affidabile per misurare il legame del substrato della glucanofosfatasi e può essere applicato a vari substrati di glucano solubilizzati.

Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane

Scopri l'assay di co-sedimentazione dell'actina per analizzare le interazioni proteiche con l'F-actina in vitro. Questo metodo biochimico permette di studiare il citoscheletro dinamico nelle cellule.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l'Analisi del Binding Protein a F-Actina

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