Name: Estrazione di RNA basata su fenolo caldo ottimizzata da micobatteri: un approccio robusto per lanalisi affidabile dellespressione genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-11T13:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato di estrazione di RNA con fenolo caldo per micobatteri come Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo economico e riproducibile garantisce RNA di alta qualità per studi trascrittomici su larga scala.

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Desidero riconoscere il supporto ricevuto dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT), dal Consiglio Indiano per la Ricerca Medica (ICMR) e dal Science and Engineering Research Board (SERB).

I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Coltura di Mycobacterium
<ol>
	<li>Inoculare 1 mL dallo stock glicerolato di Msmeg o Mtb in 10 mL di terreno Middlebrook 7H9 integrato con 0,2% di glicerolo, 0,05% di Tween 80 e 10% di ADC a 37 °C con agitazione a 150 rpm fino a quando l'OD raggiunge 1–1,5.</li>
	<li>Fare crescere la coltura secondaria aggiungendo l'1% della coltura primaria in 10 mL di terreno 7H9 fino alla fase esponenziale intermedia, OD600nm = 0,6–0,7.</li>
	<li>Distribuire in aliquote da 3 mL e centrifugare le colture a 2000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (23–25 °C).</li>
	<li>Conservare i pellet a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA. 
	ATTENZIONE: Per le colture di Mtb, seguire le appropriate linee guida BSL3 e inattivare termicamente il pellet a 95 ˚C per 20–25 minuti. 
	NOTA: Figura 1 mostra il diagramma di flusso dei passaggi fondamentali seguiti durante l'estrazione dell'RNA con il metodo del fenolo caldo.</li>
</ol>
<img alt="Diagramma dell'estrazione dell'RNA con fenolo caldo con passaggi; saggio di trascrizione; integrità dell'RNA con Qubit; analisi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig1.jpg" data-altupdatedat="1791864094000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Rappresentazione schematica del metodo del fenolo caldo e dell'analisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
2. Estrazione dell'RNA
<ol>
	<li>Metodo Hot-Phenol (metodo HP)
	<ol>
		<li>Aggiungere 200 µL di tampone TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoetanolo) al pellet cellulare e risospendere il pellet mediante vortex.</li>
		<li>Aggiungere circa 0,1 g di perle di silice da 0,1 mm al campione. Utilizzare un omogenizzatore manuale per 10–15 s fino a quando il pellet non si sarà completamente scongelato su ghiaccio. Ripetere questo passaggio per altri 2 cicli, seguiti da congelamento rapido in azoto liquido dopo ogni ripetizione.</li>
		<li>OPPURE utilizzare un omogeneizzatore meccanico ad alta velocità per 1 min a velocità 5 (5,0 m/s) a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio per 3 cicli e incubare il campione su ghiaccio per prevenire il surriscaldamento dopo ogni ciclo. 
		NOTA: Ripetere la lisi delle cellule di Mtb per 6–8 cicli (ciascun ciclo di 1 min) con un omogenizzatore manuale o un omogeneizzatore meccanico, raffreddando intermittente su ghiaccio dopo ogni ciclo. Utilizzare acqua trattata con DEPC (dietilpirocarbonato) per la preparazione di tutti i tamponi e reagenti necessari per l'estrazione dell'RNA.</li>
		<li>Aggiungere ulteriori 200 µL di tampone TES (pre-riscaldato a 65 °C) a ciascun campione per raggiungere un volume finale di 400 µL. Aggiungere a ciascun campione 200 µL di fenolo acido (fenolo equilibrato con tampone citrato 100 mM, pH 4,5) e 200 µL di cloroformio (miscelare il fenolo acido e il cloroformio in rapporto 1:1 prima di aggiungerli al campione).</li>
		<li>Incubare il campione a 65 °C su un blocco termico con agitazione a 900 rpm per 30 min e centrifugare a 12000 x g per 15 min a temperatura ambiente. Assicurarsi di ottenere una corretta separazione delle fasi dopo la centrifugazione (si osserverà una fase acquosa superiore chiara contenente l'RNA, un'interfase distinta contenente il DNA e una fase organica inferiore contenente proteine e lipidi).</li>
		<li>Prelevare lo strato superiore della fase acquosa e trasferirlo in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere nuovamente un volume equivalente di fenolo acido:cloroformio. Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a temperatura ambiente. Assicurarsi una corretta separazione delle fasi.</li>
		<li>Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta microcentrifuga pulita da 1,5 mL, quindi aggiungere 30 µL di tampone acetato di sodio 3 M, pH 5,3, e 240 µL di isopropanolo freddo. Incubare a −80 °C per 30 min – 1 h. 
		NOTA: La provetta microcentrifuga può essere conservata tutta la notte a -80 °C in questo passaggio. Sigillare la provetta microcentrifuga con più strati di parafilm per evitare che si apra a 65 °C durante l'incubazione. 
		ATTENZIONE: Il fenolo e il cloroformio sono sostanze chimiche pericolose; pertanto, è necessario utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, controlli ingegneristici come cappe aspiranti e procedure specifiche per lo smaltimento dei rifiuti.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 1 h a temperatura ambiente. Verificare la formazione del pellet e rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Risospenderе il pellet in 1 mL di etanolo al 75% e centrifugare a 12.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Eseguire questo passaggio due volte e lasciare asciugare il pellet all'aria.</li>
		<li>Risospenderе il pellet in 50 µL di acqua priva di nucleasi. 
		​NOTA: Per sciogliere l'RNA, incubarlo in acqua priva di RNasi per 10–30 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metodo TRIzol
	<ol>
		<li>Aggiungere 200 µL di reagente TRIzol al pellet cellulare. 
		ATTENZIONE: Il TRIzol è una sostanza chimica pericolosa; pertanto, è necessario utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, controlli ingegneristici come cappe aspiranti e procedure specifiche per lo smaltimento dei rifiuti.</li>
		<li>Seguire il metodo di lisi cellulare descritto nei passaggi 2.1.2 - 2.1.3.</li>
		<li>Aggiungere ulteriori 200 µL di reagente TRIzol, seguiti da 200 µL di cloroformio, e vortexare per 1 min. Centrifugare a 13.400 x g per 15 min a 4 °C. Assicurarsi una corretta separazione delle fasi dopo la centrifugazione.</li>
		<li>Trasferire con attenzione la fase acquosa in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Precipitare l'RNA aggiungendo 500 µL di isopropanolo alla fase acquosa e incubando a −80 °C per 30 min – 1 h.</li>
		<li>Formare il pellet dell'RNA mediante centrifugazione a 15.000 x g per 20 min a 4 °C. Osservare attentamente il pellet e rimuovere il soprannatante senza disturbarlo.</li>
		<li>Risospenderе il pellet con 1 mL di etanolo al 75% e centrifugare a 13.400 x g per 1 min a 4 °C. Ripetere questo passaggio due volte, lasciare asciugare il pellet per 30 min a temperatura ambiente e risospendere in 50 µL di acqua priva di nucleasi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metodo con kit commerciale per l'estrazione dell'RNA
	<ol>
		<li>Risospenderе il pellet cellulare in 200 µL di tampone di risospensione (fornito nel kit).</li>
		<li>Seguire il metodo di lisi cellulare descritto nei passaggi 2.1.2 - 2.1.3.</li>
		<li>Proseguire l'esperimento seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trattamento con DNasi, quantificazione e visualizzazione
<ol>
	<li>Per rimuovere la contaminazione da DNA genomico, aggiungere 1 µL di DNasi I (10 unità) e 5 µL di tampone RDD (1x) a ciascun campione di RNA e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
	<li>Quantificare il campione di RNA mediante spettrofotometria utilizzando Nanodrop e l'integrità dell'RNA mediante Qubit4. Il valore accettato di RIN è compreso tra 7,5 e 10. I valori accettati di A260/A280 e A260/A230 sono rispettivamente nell'intervallo 1,8–2,0 e 2,0–2,2.</li>
	<li>Visualizzare l'RNA su gel di agarosio al 1% utilizzando colorante di carico RNA 1X.</li>
</ol>
4. Sintesi del cDNA e PCR quantitativa in tempo reale
<ol>
	<li>Impostare una reazione da 20 µL per la preparazione del cDNA utilizzando il kit di trascrizione retrovirale del cDNA e 1 µg di RNA, seguendo le istruzioni del produttore in un termociclatore.</li>
	<li>Impostare una reazione di PCR in tempo reale da 10 µL utilizzando 50 ng di cDNA, 0,4 µM di ciascun primer e SYBR secondo le istruzioni del produttore. Eseguire il campione sul termociclatore per PCR in tempo reale. 
	NOTA: Per l'analisi di qPCR sono stati utilizzati i seguenti primer: 
	Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3' 
	Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3' 
	Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3' 
	Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3' 
	Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3' 
	Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'</li>
</ol>
5. Analisi statistica
<ol>
	<li>Eseguire il test t di Student t-test con tutti i replicati biologici utilizzando Graph Pad Prism, P Un valore di ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le barre di errore rappresentano l'errore standard di almeno tre replicati biologici.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report%2C+2024%22">Global tuberculosis report, 2024</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/b/74877">https://www.who.int/publications/b/74877</a> (2024).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-resistant+tuberculosis%3A+An+update+on+disease+burden%2C+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment.</a> Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).</li>
<li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+host-pathogen+cross-talk+by+transcriptional+profiling+of+both+Mycobacterium+tuberculosis+and+infected+human+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages.</a> PLoS One. 3 (1), e1403(2008).</li>
<li>Voskuil, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+respiration+by+nitric+oxide+induces+a+Mycobacterium+tuberculosis+dormancy+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program.</a> J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Yew, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+drug+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).</li>
<li>Arnvig, K. B., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+RNAs+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).</li>
<li>Brennan, P. J., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+envelope+of+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The envelope of mycobacteria.</a> Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).</li>
<li>Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBelisle%2C+JT+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. 101, 31-44 (1998).</li>
<li>Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracytoplasmic-function+sigma+factor+%CF%83H+in+Mycobacterium+tuberculosis+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression.</a> Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).</li>
<li>Rustad, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+stability+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).</li>
<li>Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+of+RNA+extraction+from+bacteria+refractory+to+disruption%2C+including+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria.</a> Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).</li>
<li>Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+efficient+method+for+the+isolation+of+DNA-free%2C+pure+and+intact+RNA+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis.</a> J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).</li>
<li>Hiebert, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+extraction+and+RNA-sequencing+method+for+transcriptomic+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis.</a> Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).</li>
<li>Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine-rich+peptides+potently+bind+ESAT6%2C+a+virulence+determinant+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+and+concurrently+affect+the+pathogen%27s+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth.</a> PLoS One. 4, e7615(2009).</li>
<li>Alli, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+RNA+extraction+in+Mycobacterium+tuberculosis+for+studying+intracellular+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Clin+Exp+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression.</a> Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).</li>
</ol>

Non vi erano conflitti di interessi tra gli autori. Tutti gli autori hanno approvato la sottomissione.

Sviluppare un metodo semplice e robusto per l'estrazione dell'RNA Mycobacterium, il metodo del fenolo caldo è stato ottimizzato. Successivamente, l'RNA estratto è stato confrontato con due approcci comunemente utilizzati: TRIzol e un metodo basato su kit con colonne12,13Queste tecniche sono state confrontate in base al rendimento, purezza, integrità dell'RNA, costo e tempo di lavorazione, al fine di valutarne l'applicabilità pratica per applicazioni mole...

M. tuberculosis (Mtb), l'agente causale della tubercolosi (TB), rimane la principale causa di morte dovuta a un singolo patogeno infettivo, superando l'HIV/AIDS. Nel 2024, la TB ha causato circa 1,3 milioni di decessi in tutto il mondo1. Questo carico è aggravato dall'aumento della prevalenza di ceppi multiresistenti (MDR) ed estensivamente resistenti ai farmaci (XDR). Pertanto, è urgente comprendere la base molecolare della patogenesi della TB e identificare nuovi bersagli terapeutici2.
Il profilo trascrizionale di Mtb è diventato uno strumento importante per chiarire gli elementi funzionali coinvolti nelle interazioni ospite-patogeno3, nell'adattamento allo stress ambientale4 e nei meccanismi alla base della resistenza ai farmaci5. Metodologie avanzate come la PCR in tempo reale, i microarray e il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) hanno notevolmente migliorato la capacità di analizzare il trascrittoma micobatterico6. Tuttavia, il successo di questi metodi dipende fortemente dalla disponibilità di RNA di alta qualità, che a sua volta dipende da una lisi cellulare efficiente durante l'estrazione. La parete cellulare complessa di Mtb, composta da miocolil–arabinogalattano–peptidoglicano, rende l'estrazione dell'RNA particolarmente difficile7. Le tecniche di lisi esistenti, tra cui l'idrolisi enzimatica8, la sonificazione9 e la lisi meccanica con perline10, richiedono spesso apparecchiature costose e grandi volumi di coltura, limitandone l'applicabilità in molti laboratori BSL-3. Inoltre, il tasso di crescita lento di Mtb richiede tempi prolungati di coltura per ottenere una biomassa sufficiente11.
Per superare questi limiti, è stato sviluppato un metodo ottimizzato di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo, rapido ed economico. Utilizzando soltanto 3 mL di coltura in fase esponenziale, il metodo consente di ottenere da 45 a 60 µg di RNA di alta qualità, adatto ad analisi trascrittomique successive. La lisi cellulare viene ottenuta mediante un omogenizzatore tissutale portatile compatto e reagenti facilmente reperibili, eliminando la necessità di strumenti costosi. Sebbene il metodo del fenolo caldo sia stato descritto in precedenza11,12, la versione ottimizzata migliora praticità, convenienza economica e resa di RNA. L'ottimizzazione è stata effettuata utilizzando M. smegmatis mc2155 (Msmeg) ed è stata convalidata con successo su Mtb H37Rv.

<table><tbody><tr><td>sfere di silice da 0,1 mm</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP116911050</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 4&amp;nbsp;</td><td>revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga fredda</td><td>ThermoScientific</td><td>42541217</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I&amp;nbsp;</td><td>qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>E02SS</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SRL</td><td>62889</td><td></td></tr><tr><td>blocco riscaldante</td><td>MIULAB</td><td>MU-E02-1049</td><td></td></tr><tr><td>kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>macinatore meccanico per tessuti G10</td><td>Coron</td><td>G22616008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Nanophotometro N50&amp;nbsp;</td><td>IMPLEM</td><td>T51601</td><td></td></tr><tr><td>fenolo equilibrato con tampone citrato 0,1 M, pH 4,5</td><td>Sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>fluorimetro Qubit 4&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2.32262E+12</td><td></td></tr><tr><td>ciclatore termico per PCR in tempo reale</td><td>Analytik Jena AG</td><td>844-00503-2</td><td></td></tr><tr><td>kit RNA easy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>acetato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>ciclatore termico&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>621BR29739</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>516732</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione di rna basata su fenolo caldo ottimizzata da micobatteri: un approccio robusto per l'analisi affidabile dell'espressione genica

Optimized Hot Phenol&#8211;Based RNA Extraction from Mycobacteria: A Robust Approach for Reliable Gene Expression Analysis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) rimane una grave minaccia per la salute globale, evidenziando la necessità di studi trascrittomica affidabili per comprenderne la biologia e i meccanismi di resistenza ai farmaci. Tali analisi dipendono dall'ottenimento di RNA di alta qualità e resa elevata. Sebbene siano disponibili diversi metodi di estrazione dell'RNA, molti richiedono reagenti costosi, grandi volumi di coltura o attrezzature specializzate, limitandone l'adeguatezza per studi su larga scala, in particolare in contesti con risorse limitate. In questo lavoro viene presentato un metodo ottimizzato di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo, specificamente adattato per i micobatteri. Il metodo utilizza un volume minimo di coltura e reagenti comunemente disponibili, garantendo costantemente RNA di alta qualità adatto ad applicazioni trascrittomiche ad alto rendimento. La quantità e l'integrità dell'RNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel e analisi dell'integrità dell'RNA (RIN), mentre la sua idoneità per applicazioni successive è stata confermata mediante qPCR e Qubit 4. Per confrontare le prestazioni del metodo ottimizzato, è stata effettuata un'estrazione parallela dell'RNA utilizzando TRIzol e RNeasy in condizioni sperimentali identiche, inclusa la stessa specie di Mycobacterium, volume di coltura, fase di crescita (logaritmica e stazionaria) e condizioni di lisi. Ciò ha permesso un confronto diretto in termini di resa, qualità, fattibilità e costo. Il metodo ottimizzato con fenolo caldo ha dimostrato una resa e una qualità dell'RNA paragonabili o migliori, riducendo significativamente il costo dei reagenti e la dipendenza da attrezzature specializzate. Grazie alla sua efficienza, riproducibilità e convenienza economica, questo protocollo rappresenta un'alternativa pratica per studi su larga scala di espressione genica e trascrittomica in Mtb e in altre specie di micobatteri.

Qualità e resa dell'RNA
La qualità e la quantità dell'RNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2). Sono state osservate bande distinte e ben definite corrispondenti all'rRNA 23S e 16S per tutti i metodi di estrazione, confermando un isolamento riuscito di RNA totale. I metodi con fenolo caldo e TRIzol hanno mostrato tre bande chiare corrispondenti all'rRNA 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) e 5S (~120 ...

Questo studio ottimizza un metodo di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo per Mycobacterium, producendo RNA di alta qualità adatto ad analisi trascrittomique. Confrontato con TRIzol e RNeasy in condizioni identiche, il metodo ha fornito un resa superiore, integrità comparabile e una maggiore efficienza economica, offrendo un'alternativa pratica per studi su larga scala dell'espressione genica.

Estrazione di RNA basata su fenolo caldo ottimizzata da micobatteri: un approccio robusto per l'analisi affidabile dell'espressione genica

*Mycobacterium tuberculosis* (Mtb) continua a rappresentare una delle principali minacce per la salute globale, sottolineando la necessità di studi trascrittomici affidabili per comprenderne la biologia...

La nostra ricerca si concentra sull'analisi del trascrittoma dell'adattamento micobatterico all'interno del microambiente dell'ospite, utilizzando un metodo affidabile ed efficiente di estrazione dell'RNA. Questo protocollo rapido, affidabile e ottimizzato utilizza sostanze chimiche di routine e un'attrezzatura minima, superando le difficoltà tecniche associate all'estrazione di RNA di alta qualità da micobatteri. Per iniziare, inoculare uno stock glicerolato di un millilitro di Mycobacterium smegmatis o Mycobacterium tuberculosis in 10 millilitri di terreno Middlebrook 7H9, integrato con 0,2% di glicerolo, 0,05% di Tween 80 e 10% di albumina dextrosio catalasi.Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 150 giri al minuto fino a quando la densità ottica raggiunge un valore compreso tra 1 e 1,5 per ottenere la coltura primaria. Per ottenere la coltura secondaria, aggiungere l'1% della coltura primaria a 10 millilitri di mezzo 7H9 e incubare fino a quando la coltura raggiunge la fase logaritmica intermedia con una densità ottica compresa tra 0,6 e 0,7 a 600 nanometri. Suddividere la coltura in aliquote da tre millilitri e centrifugare a 2.000 g per cinque minuti a una temperatura c

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Vi presentiamo un metodo per la generazione di cDNA da mRNA ambientale. In generale, l'RNA totale viene prima raccolto dall'ambiente, è selettivamente rimosso rRNA, mRNA è selettivamente amplificato, e cDNA sintetizzato dalla piscina mRNA arricchito è sequenziato. Sequenze recuperato può essere annotati utilizzando le normali tecniche di bioinformatica per identificare i geni espressi.

Analisi di espressione genica da comunità microbiche marine utilizzando Trascrittomica Ambientale

Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Microdissezione è stato ampiamente impiegato per l'esame di DNA, RNA e proteine ​​nel tessuto. Microscopia laser capture (LCM) è il metodo più comunemente usato, ma una nuova tecnica di fresatura, mesodissection, è da poco disponibile. Dimostriamo estrazione di RNA da mesodissected in formalina paraffina fissati diapositive tessuti integrati di Mycobacterium tuberculosis granulomi.

Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi

Questo manoscritto descrive l'uso della tecnologia all'avanguardia fornita dai DNA-microarrays. I microarray forniscono una panoramica dei cambiamenti trascrittomici nei batteri che si verificano in una condizione specifica. Inoltre, sottolineiamo la facilità con cui è possibile analizzare grandi quantità di dati utilizzando comodi pacchetti software sviluppati internamente.

A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un&#39;analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Abbiamo sviluppato un protocollo veloce, sensibile e riproducibile per la profilazione dell'espressione genica dei patogeni durante un'infezione.

Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Qui, presentiamo due protocolli per studiare le interazioni fagocita -abscessus del micobatterio : lo screening di una libreria di mutante trasposone per carenza intracellulare batterica e la determinazione del trascrittoma batterica intracellulare da RNA sequenziamento. Entrambi gli approcci forniscono approfondimenti i vantaggi genomici e trascrittomica adattamenti migliorare fitness batteri intracellulari.

Identificazione di fattori di virulenza di Mycobacterium abscessus per replica intracellulare nei fagociti

Il sequenziamento dell'RNA a quantificazione assoluta (AQRNA-seq) è una tecnologia sviluppata per quantificare il panorama di tutti i piccoli RNA nelle miscele biologiche. Qui, vengono dimostrate sia le fasi di preparazione della libreria che quelle di elaborazione dei dati di AQRNA-seq, quantificando i cambiamenti nel pool di RNA di trasferimento (tRNA) in Mycobacterium bovis BCG durante la dormienza indotta dalla fame.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Questo protocollo dimostra che il beadbeating combinato con la purificazione delle microsfere per la cattura del DNA fornisce un metodo rapido e coerente per estrarre il DNA da campioni di Mycobacterium tuberculosis , rendendolo una scelta efficace per le applicazioni di sequenziamento di nuova generazione.

Estrazione del DNA micobatterico mediante battitura del tallone in tampone personalizzato seguita da flusso di lavoro NGS

Scopri un protocollo ottimizzato di estrazione di RNA con fenolo caldo per micobatteri come Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo economico e riproducibile garantisce RNA di alta qualità per studi trascrittomici su larga scala.

Estrazione di RNA basata su fenolo caldo ottimizzata da micobatteri: un approccio robusto per lanalisi affidabile dellespressione genica (Video) | JoVE Journal

Estrazione di RNA basata su fenolo caldo ottimizzata da micobatteri: un approccio robusto per l'analisi affidabile dell'espressione genica

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