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Desidero riconoscere il supporto ricevuto dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT), dal Consiglio Indiano per la Ricerca Medica (ICMR) e dal Science and Engineering Research Board (SERB).

I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Coltura di Mycobacterium
<ol>
	<li>Inoculare 1 mL dallo stock glicerolato di Msmeg o Mtb in 10 mL di mezzo Middlebrook 7H9 integrato con il 0,2% di glicerolo, lo 0,05% di Tween 80 e il 10% di ADC a 37 °C con agitazione a 150 rpm fino a quando l'OD raggiunge 1–1,5.</li>
	<li>Far crescere la coltura secondaria aggiungendo l'1% della coltura primaria in 10 mL di mezzo 7H9 fino alla fase esponenziale intermedia, OD600nm = 0,6–0,7.</li>
	<li>Distribuire in aliquote da 3 mL e centrifugare le colture a 2000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (23–25 °C).</li>
	<li>Conservare i pellet a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA. 
	ATTENZIONE: Per le colture di Mtb, seguire le corrette linee guida BSL3 e inattivare termicamente il pellet a 95 ˚C per 20–25 minuti. 
	NOTA: Figura 1 mostra il diagramma di flusso dei passaggi fondamentali seguiti durante l'estrazione dell'RNA con il metodo del fenolo caldo.</li>
</ol>
<img alt="Diagramma dell'estrazione dell'RNA con fenolo caldo; il flusso di lavoro mostra la centrifugazione, la separazione delle fasi e l'analisi dell'integrità dell'RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig1.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Rappresentazione schematica del metodo Hot-Phenol e dell'analisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
2. Estrazione dell'RNA
<ol>
	<li>Metodo Hot-Phenol (metodo HP)
	<ol>
		<li>Aggiungere 200 µL di tampone TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoetanolo) al pellet cellulare e risospendere il pellet mediante vortex.</li>
		<li>Aggiungere circa 0,1 g di perle di silice da 0,1 mm al campione. Utilizzare un omogenizzatore manuale per 10–15 secondi fino a quando il pellet non si sarà completamente scongelato su ghiaccio. Ripetere questo passaggio per altri 2 cicli, seguiti da congelamento rapido in azoto liquido dopo ogni ripetizione.</li>
		<li>OPPURE utilizzare un disintegratore meccanico ad alta velocità da banco per 1 minuto alla velocità di 5 (5,0 m/s) a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio per 3 cicli e incubare il campione su ghiaccio per prevenire il surriscaldamento dopo ogni ciclo. 
		NOTA: Ripetere la lisi delle cellule di Mtb per 6–8 cicli (ciascun ciclo di 1 minuto) con un omogenizzatore manuale o un disintegratore meccanico, raffreddando intermittente su ghiaccio dopo ogni ciclo. Utilizzare acqua trattata con DEPC (dietilpirocarbonato) per la preparazione di tutti i tamponi e reagenti necessari per l'estrazione dell'RNA.</li>
		<li>Aggiungere ulteriori 200 µL di tampone TES (preriscaldato a 65 °C) a ciascun campione per portare il volume a 400 µL. Aggiungere a ciascun campione 200 µL di fenolo acido (fenolo equilibrato con tampone citrato 100 mM, pH 4,5) e 200 µL di cloroformio (miscelare il fenolo acido e il cloroformio in rapporto 1:1 prima di aggiungerli al campione).</li>
		<li>Incubare il campione a 65 °C su un blocco termico con agitazione a 900 rpm per 30 minuti e centrifugare a 12000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi di ottenere una corretta separazione delle fasi dopo la centrifugazione (si osserverà una fase acquosa superiore chiara contenente l'RNA, un'interfase distinta contenente il DNA e una fase organica inferiore contenente proteine e lipidi).</li>
		<li>Prelevare lo strato superiore della fase acquosa e trasferirlo in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere nuovamente un volume equivalente di fenolo acido:cloroformio. Centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi di ottenere una corretta separazione delle fasi.</li>
		<li>Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta microcentrifuga pulita da 1,5 mL, quindi aggiungere 30 µL di tampone acetato di sodio 3 M, pH 5,3, e 240 µL di isopropanolo freddo. Incubare a −80 °C per 30 minuti fino a 1 ora. 
		NOTA: La provetta microcentrifuga può essere conservata tutta la notte a -80 °C in questo passaggio. Sigillare la provetta microcentrifuga con più strati di parafilm per evitare che si apra a 65 °C durante l'incubazione. 
		ATTENZIONE: Il fenolo e il cloroformio sono sostanze chimiche pericolose; pertanto, è necessario utilizzare idonei dispositivi di protezione individuale (DPI), controlli ingegneristici come cappe aspiranti e seguire specifiche procedure di smaltimento dei rifiuti.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 1 ora a temperatura ambiente. Verificare la formazione del pellet e rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Risospenderе il pellet in 1 mL di etanolo al 75% e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente. Eseguire questo passaggio due volte ed essiccare il pellet all'aria.</li>
		<li>Risospenderе il pellet in 50 µL di acqua priva di nucleasi. 
		​NOTA: Per sciogliere l'RNA, incubarlo in acqua priva di RNasi per 10–30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metodo TRIzol
	<ol>
		<li>Aggiungere 200 µL di reagente TRIzol al pellet cellulare. 
		ATTENZIONE: Il TRIzol è una sostanza chimica pericolosa; pertanto, è necessario utilizzare idonei dispositivi di protezione individuale (DPI), controlli ingegneristici come cappe aspiranti e seguire specifiche procedure di smaltimento dei rifiuti.</li>
		<li>Seguire il metodo di lisi cellulare descritto nei passaggi 2.1.2 - 2.1.3.</li>
		<li>Aggiungere ulteriori 200 µL di reagente TRIzol, seguiti da 200 µL di cloroformio, e vortexare per 1 minuto. Centrifugare a 13.400 x g per 15 minuti a 4 °C. Assicurarsi di ottenere una corretta separazione delle fasi dopo la centrifugazione.</li>
		<li>Trasferire con attenzione la fase acquosa in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Precipitare l'RNA aggiungendo 500 µL di isopropanolo alla fase acquosa e incubando a −80 °C per 30 minuti fino a 1 ora.</li>
		<li>Formare il pellet dell'RNA mediante centrifugazione a 15.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Osservare attentamente il pellet e rimuovere il soprannatante senza disturbarlo.</li>
		<li>Risospenderе il pellet con 1 mL di etanolo al 75% e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto a 4 °C. Ripetere questo passaggio due volte, essiccare il pellet per 30 minuti a temperatura ambiente e risospendere in 50 µL di acqua priva di nucleasi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metodo con kit commerciale per l'estrazione dell'RNA
	<ol>
		<li>Risospenderе il pellet cellulare in 200 µL di tampone di risospensione (fornito nel kit).</li>
		<li>Seguire il metodo di lisi cellulare descritto nei passaggi 2.1.2 - 2.1.3.</li>
		<li>Eseguire i passaggi successivi seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trattamento con DNasi, quantificazione e visualizzazione
<ol>
	<li>Per rimuovere la contaminazione da DNA genomico, aggiungere 1 µL di DNasi I (10 unità) e 5 µL di tampone RDD (1x) a ciascun campione di RNA e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
	<li>Quantificare il campione di RNA mediante spettrofotometria utilizzando Nanodrop e l'integrità dell'RNA mediante Qubit4. Il valore accettato di RIN è compreso tra 7,5 e 10. I valori accettati di A260/A280 e A260/A230 sono rispettivamente nell'intervallo 1,8–2,0 e 2,0–2,2.</li>
	<li>Visualizzare l'RNA su gel di agarosio al 1% utilizzando colorante di carico RNA 1X.</li>
</ol>
4. Sintesi del cDNA e PCR quantitativa in tempo reale 
<ol>
	<li>Impostare una reazione da 20 µL per la preparazione del cDNA utilizzando il kit di trascrizione retrovirale del cDNA e 1 µg di RNA, seguendo le istruzioni del produttore in un termociclatore.</li>
	<li>Impostare una reazione di PCR in tempo reale da 10 µL utilizzando 50 ng di cDNA, 0,4 µM di ciascun primer e SYBR secondo le istruzioni del produttore. Eseguire il campione sul termociclatore per PCR in tempo reale. 
	NOTA: Per l'analisi di qPCR sono stati utilizzati i seguenti primer: 
	Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3' 
	Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3' 
	Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3' 
	Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3' 
	Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3' 
	Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'</li>
</ol>
5. Analisi statistica
<ol>
	<li>Eseguire il test t di Student t-test con tutti i replicati biologici utilizzando Graph Pad Prism, P Un valore di ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le barre di errore rappresentano l'errore standard di almeno tre replicati biologici.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report%2C+2024%22">Global tuberculosis report, 2024</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/b/74877">https://www.who.int/publications/b/74877</a> (2024).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-resistant+tuberculosis%3A+An+update+on+disease+burden%2C+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment.</a> Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).</li>
<li>Tailleux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+host-pathogen+cross-talk+by+transcriptional+profiling+of+both+Mycobacterium+tuberculosis+and+infected+human+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages.</a> PLoS One. 3 (1), e1403(2008).</li>
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<li>Brennan, P. J., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+envelope+of+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The envelope of mycobacteria.</a> Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).</li>
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<li>Rustad, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+stability+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).</li>
<li>Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+of+RNA+extraction+from+bacteria+refractory+to+disruption%2C+including+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria.</a> Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).</li>
<li>Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+efficient+method+for+the+isolation+of+DNA-free%2C+pure+and+intact+RNA+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis.</a> J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).</li>
<li>Hiebert, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+extraction+and+RNA-sequencing+method+for+transcriptomic+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis.</a> Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).</li>
<li>Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine-rich+peptides+potently+bind+ESAT6%2C+a+virulence+determinant+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+and+concurrently+affect+the+pathogen%27s+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth.</a> PLoS One. 4, e7615(2009).</li>
<li>Alli, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+RNA+extraction+in+Mycobacterium+tuberculosis+for+studying+intracellular+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Clin+Exp+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression.</a> Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).</li>
</ol>

Non vi erano conflitti di interessi tra gli autori. Tutti gli autori hanno approvato la sottomissione.

Sviluppare un metodo semplice e robusto per l'estrazione dell'RNA Mycobacterium, il metodo del fenolo caldo è stato ottimizzato. Successivamente, l'RNA estratto è stato confrontato con due approcci comunemente utilizzati: TRIzol e un metodo basato su kit con colonne12,13Queste tecniche sono state confrontate in base al rendimento, purezza, integrità dell'RNA, costo e tempo di lavorazione, al fine di valutarne l'applicabilità pratica per applicazioni molecolari successive. I metodi Hot Phenol e TRIzol, sebbene relativamente più lunghi rispetto al metodo basato su kit, hanno prodotto RNA integro e di alta qualità. Tutti e tre i metodi hanno fornito RNA con purezza e integrità comparabili; tuttavia, il metodo Hot Phenol ha garantito in modo costante un rendimento maggiore di RNA. Inoltre, l'RNA estratto con i metodi Hot Phenol e TRIzol ha prodotto valori di Ct simili. Tuttavia, è stata osservata una differenza statisticamente significativa nei valori di Ct tra i metodi Hot Phenol e RNeasy. Poiché nell'esperimento sono state utilizzate quantità uguali di RNA, ci si aspettava che i valori di Ct fossero simili per tutti i metodi. Le differenze osservate nel caso del metodo RNeasy potrebbero essere attribuite a variazioni nella chimica dell'estrazione dell'RNA. I metodi Hot Phenol e TRIzol sono basati su solventi organici e risultano spesso più efficaci nel solubilizzare trascritti difficili, come quelli che codificano per proteine intrinseche di membrana o trascritti con alto contenuto di GC. Al contrario, RNeasy è un metodo basato su colonne di silice e può determinare un recupero inferiore di alcuni trascritti che non si legano in modo efficiente alla membrana o che vengono persi durante i passaggi di lavaggio, rispetto ai metodi basati su fenolo.Figura 2). È importante notare che rese di RNA comparabili sono state ottenute sia utilizzando un omogenizzatore manuale per tessuti sia un bead beater per la lisi cellulare, consentendo così flessibilità operativa nella procedura di lisi. Inoltre, il metodo di estrazione è stato ottimizzato per essere utilizzato con bassi volumi di coltura e senza la necessità di centrifugazione a freddo. Questa semplificazione aumenta la facilità complessiva e l'efficienza della lavorazione dei campioni.
Un fattore importante nella scelta di un metodo di estrazione dell'RNA è il bilanciamento tra costo, tempo e qualità del prodotto finale (Tabella 1). Il metodo Hot Phenol, sebbene leggermente più lungo, rimane altamente conveniente grazie all'utilizzo di reagenti di laboratorio comuni e alla capacità di produrre rese elevate di RNA (60–70 µg di RNA da Msmeg e 35–45 µg di RNA da Mtb per 3 mL di coltura in fase logaritmica media), anche a partire da un basso volume di coltura di 3 mL e senza l'uso di apparecchiature sofisticate per la rottura meccanica con perle, richieste dalla maggior parte dei metodi pubblicati fino ad oggi. Ciò lo rende particolarmente vantaggioso per laboratori che operano in condizioni di risorse limitate. I metodi precedentemente pubblicati di estrazione dell'RNA basati sul fenolo caldo differiscono in diversi aspetti fondamentali. Ad esempio, Mangan et al. hanno utilizzato M. bovis per l'estrazione dell'RNA mediante il metodo del fenolo caldo, riportando una resa di circa 20 µg di RNA per 109 cellule. Tuttavia, parametri critici come il volume della coltura e la temperatura di estrazione non sono stati chiaramente specificati. Inoltre, il loro metodo prevede un lavaggio con detergente utilizzando Divolab-1 prima della rottura meccanica delle cellule, un reagente non facilmente reperibile, seguito da estrazione con cloroformio e alcool isoamilo11. In un altro metodo con fenolo caldo, l'RNA è stato estratto da cellule di Mtb, ottenendo circa 39 µg di RNA totale, valore paragonabile al metodo ottimizzato descritto in questo lavoro. Tuttavia, questo metodo richiedeva un volume di coltura relativamente elevato (25 mL), aumentando il tempo di lavorazione e rendendo necessario l'uso di centrifughe di dimensioni maggiori. Inoltre, l'estrazione prevede una miscela di cloroformio–alcool isoamilo e la temperatura di estrazione non è indicata12,14. TRIzol è ampiamente utilizzato anche per ottenere una buona resa e qualità di RNA a un costo moderato15; tuttavia, la resa è risultata relativamente bassa. Il kit RNeasy offre un'elevata praticità e velocità, risultando adatto a flussi di lavoro sensibili al tempo o a utenti meno esperti, ma a un costo notevolmente superiore rispetto agli altri due metodi, con una resa significativamente ridotta. In sintesi, il metodo qui descritto offre flessibilità operativa nella lisi delle cellule micobatteriche e nella successiva estrazione dell'RNA. Consente agli utenti di scegliere il metodo più adatto in base alle proprie priorità, siano esse costo e resa oppure tempo di elaborazione, mantenendo una qualità e integrità dell'RNA paragonabile nei tre metodi.

M. tuberculosis (Mtb), l'agente causale della tubercolosi (TB), rimane la principale causa di morte dovuta a un singolo patogeno infettivo, superando l'HIV/AIDS. Nel 2024, la TB ha causato circa 1,3 milioni di decessi in tutto il mondo1. Questo carico è aggravato dall'aumento della prevalenza di ceppi multiresistenti (MDR) ed estensivamente resistenti ai farmaci (XDR). Pertanto, è urgente comprendere la base molecolare della patogenesi della TB e identificare nuovi bersagli terapeutici2.
Il profilo trascrizionale di Mtb è diventato uno strumento importante per chiarire gli elementi funzionali coinvolti nelle interazioni ospite-patogeno3, nell'adattamento allo stress ambientale4 e nei meccanismi alla base della resistenza ai farmaci5. Metodologie avanzate come la PCR in tempo reale, i microarray e il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) hanno notevolmente migliorato la capacità di analizzare il trascrittoma micobatterico6. Tuttavia, il successo di questi metodi dipende fortemente dalla disponibilità di RNA di alta qualità, che a sua volta dipende da una lisi cellulare efficiente durante l'estrazione. La parete cellulare complessa di Mtb, composta da miocolil–arabinogalattano–peptidoglicano, rende l'estrazione dell'RNA particolarmente difficile7. Le tecniche di lisi esistenti, tra cui l'idrolisi enzimatica8, la sonificazione9 e la lisi meccanica con perline10, richiedono spesso apparecchiature costose e grandi volumi di coltura, limitandone l'applicabilità in molti laboratori BSL-3. Inoltre, il tasso di crescita lento di Mtb richiede tempi prolungati di coltura per ottenere una biomassa sufficiente11.
Per superare questi limiti, è stato sviluppato un metodo ottimizzato di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo, rapido ed economico. Utilizzando soltanto 3 mL di coltura in fase esponenziale, il metodo consente di ottenere da 45 a 60 µg di RNA di alta qualità, adatto ad analisi trascrittomique successive. La lisi cellulare viene ottenuta mediante un omogenizzatore tissutale portatile compatto e reagenti facilmente reperibili, eliminando la necessità di strumenti costosi. Sebbene il metodo del fenolo caldo sia stato descritto in precedenza11,12, la versione ottimizzata migliora praticità, convenienza economica e resa di RNA. L'ottimizzazione è stata effettuata utilizzando M. smegmatis mc2155 (Msmeg) ed è stata convalidata con successo su Mtb H37Rv.

<table><tbody><tr><td>sfere di silice da 0,1 mm</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP116911050</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 4&amp;nbsp;</td><td>revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga fredda</td><td>ThermoScientific</td><td>42541217</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I&amp;nbsp;</td><td>qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>E02SS</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SRL</td><td>62889</td><td></td></tr><tr><td>blocco riscaldante</td><td>MIULAB</td><td>MU-E02-1049</td><td></td></tr><tr><td>kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>macinatore meccanico per tessuti G10</td><td>Coron</td><td>G22616008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Nanophotometro N50&amp;nbsp;</td><td>IMPLEM</td><td>T51601</td><td></td></tr><tr><td>fenolo equilibrato con tampone citrato 0,1 M, pH 4,5</td><td>Sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>fluorimetro Qubit 4&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2.32262E+12</td><td></td></tr><tr><td>ciclatore termico per PCR in tempo reale</td><td>Analytik Jena AG</td><td>844-00503-2</td><td></td></tr><tr><td>kit RNA easy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>acetato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>ciclatore termico&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>621BR29739</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>516732</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione di rna basata su fenolo caldo ottimizzata da micobatteri: un approccio robusto per l'analisi affidabile dell'espressione genica

Optimized Hot Phenol&#8211;Based RNA Extraction from Mycobacteria: A Robust Approach for Reliable Gene Expression Analysis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) rimane una grave minaccia per la salute globale, evidenziando la necessità di studi trascrittomica affidabili per comprenderne la biologia e i meccanismi di resistenza ai farmaci. Tali analisi dipendono dall'ottenimento di RNA di alta qualità e resa elevata. Sebbene siano disponibili diversi metodi di estrazione dell'RNA, molti richiedono reagenti costosi, grandi volumi di coltura o attrezzature specializzate, limitandone l'adeguatezza per studi su larga scala, in particolare in contesti con risorse limitate. In questo lavoro viene presentato un metodo ottimizzato di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo, specificamente adattato per i micobatteri. Il metodo utilizza un volume minimo di coltura e reagenti comunemente disponibili, garantendo costantemente RNA di alta qualità adatto ad applicazioni trascrittomiche ad alto rendimento. La quantità e l'integrità dell'RNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel e analisi dell'integrità dell'RNA (RIN), mentre la sua idoneità per applicazioni successive è stata confermata mediante qPCR e Qubit 4. Per confrontare le prestazioni del metodo ottimizzato, è stata effettuata un'estrazione parallela dell'RNA utilizzando TRIzol e RNeasy in condizioni sperimentali identiche, inclusa la stessa specie di Mycobacterium, volume di coltura, fase di crescita (logaritmica e stazionaria) e condizioni di lisi. Ciò ha permesso un confronto diretto in termini di resa, qualità, fattibilità e costo. Il metodo ottimizzato con fenolo caldo ha dimostrato una resa e una qualità dell'RNA paragonabili o migliori, riducendo significativamente il costo dei reagenti e la dipendenza da attrezzature specializzate. Grazie alla sua efficienza, riproducibilità e convenienza economica, questo protocollo rappresenta un'alternativa pratica per studi su larga scala di espressione genica e trascrittomica in Mtb e in altre specie di micobatteri.

Qualità e resa dell'RNA
La qualità e la quantità dell'RNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2). Per tutti i metodi di estrazione sono state osservate bande distinte e ben definite corrispondenti all'rRNA 23S e 16S, confermando un isolamento riuscito di RNA totale. I metodi con fenolo caldo e TRIzol hanno mostrato tre bande chiare rappresentanti l'rRNA 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) e 5S (~120 pb), indicando un RNA integro e di alta qualità. Al contrario, il metodo basato su colonne ha mostrato soltanto le bande 23S e 16S, mentre la banda dell'rRNA 5S era assente o al di sotto del limite di rilevamento, probabilmente a causa della perdita selettiva di RNA di piccole dimensioni durante la purificazione su colonna. Dal punto di vista quantitativo, il metodo con fenolo caldo ha prodotto da 1,5 a 2 volte più RNA rispetto ai metodi TRIzol e RNeasy, rispettivamente (Figura 2A,C). I rendimenti medi sono stati di circa 60 µg per il fenolo caldo, circa 45 µg per TRIzol e circa 30 µg per RNeasy, quest'ultimo rappresentante un rendimento inferiore del ~50% rispetto al fenolo caldo. Nonostante le differenze nei rendimenti, l'integrità e la purezza dell'RNA sono risultate comparabili tra i diversi metodi (Figura 2D,E).
Per valutare l'efficienza dell'approccio di lisi, l'RNA è stato estratto anche utilizzando un disintegratore a sferette. Sono stati ottenuti rendimenti, qualità e integrità comparabili, dimostrando che una lisi efficace può essere raggiunta mediante un semplice omogenizzatore manuale per tessuti, senza ricorrere a strumentazioni specializzate come il disintegratore/beccucciatore a sferette (Figura 2B,F–H).
Poiché Mtb è più resistente alla lisi rispetto a Msmeg, abbiamo ulteriormente convalidato il metodo Hot Phenol ottimizzato utilizzando il ceppo Mtb H37Rv. La lisi cellulare ottenuta sia con il maceratore tissutale che con il bead ruptor ha prodotto RNA con resa, qualità e integrità elevate (Figura 3A–D), confermando la robustezza del metodo. Sebbene l'estrazione di RNA mediante maceratore tissutale manuale abbia fornito una resa inferiore (~35–45 µg/3 mL di coltura) rispetto al bead ruptor (50–60 µg/3 mL), la differenza non si è rivelata statisticamente significativa, e inoltre la quantità ottenuta rientra in un intervallo accettabile, sufficiente per studi su larga scala dell'espressione genica. Tutte le estrazioni di RNA sono state ripetute più volte, e tutti i replicati biologici indipendenti sono stati presentati. È stata effettuata un'analisi densitometrica sulle immagini elettroforetiche, che ulteriormente conferma le differenze statistiche nella resa di RNA tra i diversi metodi, evidenziando come il metodo Hot Phenol fornisca la resa più elevata (Figura supplementare 1A–D).
Purezza e integrità dell'RNA
Tutti i metodi hanno prodotto RNA con rapporti A260/A280 accettabili intorno a 2,0, indicanti una minima contaminazione proteica (Figura 2D). L'integrità dell'RNA (RIN) è risultata comparabile tra tutti i metodi, con valori compresi tra 7,5 e 10 (Figura 2D–H, Supplementare Figura 2, pannello inferiore). Ciò indica una buona qualità, integrità e minima degradazione.
Analisi di PCR quantitativa per verificare la qualità dell'RNA 
Per valutare l'idoneità dell'RNA estratto con ciascun metodo per studi successivi sull'espressione genica, è stato eseguito un qRT-PCR. È stata analizzata l'espressione genica del gene di controllo costitutivo Msmeg, mysA (MSMEG 2758), e di due regolatori trascrizionali, sigE (MSMEG 5072) e sigH (MSMEG 1914), utilizzando quantità equivalenti di RNA in ingresso. I valori di Ct (soglia del ciclo) ottenuti riflettono l'abbondanza relativa di RNA integro e amplificabile in ciascun campione. Come mostrato in (Figura 2I), l'RNA estratto con il metodo del fenolo caldo e con TRIzol ha prodotto valori di Ct comparabili, compresi tra circa 22 e 25, indicando una maggiore integrità dell'RNA e una migliore compatibilità con la trascrizione inversa e l'amplificazione. Il metodo basato su kit ha mostrato valori di Ct leggermente più elevati (~27–30), indicativi di livelli inferiori di trascritto rilevabile. L'analisi della curva di denaturazione ha evidenziato un'amplificazione specifica dei geni mysA, sigE e sigH, dimostrando specificità ed efficienza del qPCR (Figura supplementare 2, pannello superiore). L'analisi qPCR effettuata con geni di Mtb ha mostrato valori di Ct accettabili (~20–25), confermando l'idoneità per studi successivi sull'espressione genica (Figura 3E).
<img alt="Confronto dell&#x27;estrazione dell&#x27;RNA; elettroforesi su gel (28S, 18S, 5S) e istogrammi del rendimento, del valore Ct e della purezza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Confronto tra metodi di estrazione dell'RNA per Mycobacterium. (AElettroforesi su gel di agarosio che mostra l'RNA totale estratto mediante i metodi Hot Phenol, TRIzol e RNeasy. In tutti i campioni sono visibili bande distinte di rRNA 23S e 16S, indicanti RNA integro.BElettroforesi su gel di agarosio che mostra l'RNA totale estratto utilizzando il fenolo caldo tramite diversi metodi di lisi, ovvero bead ruptor e macinatore tissutale manuale. (CResa totale di RNA, con la resa più elevata ottenuta con il metodo del fenolo caldo, seguito da TRIzol e dal metodo con kit.DLa purezza dell'RNA è stata valutata mediante i rapporti A260/A280, con tutti i metodi che hanno fornito valori intorno a ~2,0, indicativi di una minima contaminazione proteica.E) Numero di integrità dell'RNA (RIN) che mostra un'integrità comparabile. (F–HConfronto tra resa di RNA, rapporto 260/280 e integrità dell'RNA in campioni lisati mediante omogeneizzatore manuale e Bead Ruptor ed isolati con il metodo Hot Phenol.I) Valori di Ct da qRT-PCR rivolti a un gene di controllo (ad esempio, mysA) e fattori trascrizionali (sigE e sigHLe barre di errore rappresentano l'errore standard di tre replicati biologici (n = 3). P-valore calcolato utilizzando il test t di Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig2largev2.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Confronto dell'estrazione di RNA da Mycobacterium, elettroforesi su gel e grafici a barre per l'analisi resa e purezza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig3.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Isolamento di RNA da Mtb mediante il metodo fenolo caldo. (A) Elettroforesi su gel di agarosio che mostra l'RNA totale estratto utilizzando il bead ruptor e un omogenizzatore manuale con il metodo fenolo caldo ottimizzato da ceppo Mtb H37Rv. (B–D) Confronto dell'RNA isolato in termini di resa, rapporto 260/280 e stima dell'integrità dell'RNA (RIN). (E) Valori di Ct ottenuti da qRT-PCR mirata ai geni sigA, 16s rRNA e hsp70. Le barre di errore rappresentano l'errore standard di tre replicati biologici (n = 3). P-valore calcolato utilizzando il test t di Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig3large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fenolo caldo</td>
			<td>Trizol</td>
			<td>Kit RNeasy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rendimento</td>
			<td>60 -70 μg</td>
			<td>35 -50 μg</td>
			<td>30 - 45 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempo</td>
			<td>2,5-3 ore</td>
			<td>2-2,5 ore</td>
			<td>30-45 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costo/reattivo</td>
			<td>$0,10 – $0,20</td>
			<td>$1,500 – $2,00</td>
			<td>$7,00 – $10,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limitazioni</td>
			<td> Lungo tempo di esecuzione, denaturanti forti (fenolo/SDS)</td>
			<td> Lungo tempo di esecuzione, reagenti altamente tossici come il Trizol, necessità di centrifuga fredda, costo 15 volte superiore al metodo del fenolo caldo</td>
			<td>Costoso (72 volte più costoso rispetto al fenolo caldo), resa inferiore, intasamento delle colonne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vantaggi</td>
			<td>Rendimento maggiore da volumi minori, basso costo, nessuna necessità di omogeneizzatore per la lisi cellulare, nessuna necessità di centrifugazione a freddo</td>
			<td>Rendimento moderato e costo moderato, necessità di centrifugazione a freddo</td>
			<td>Rendimento moderato, molto costoso</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Principale fattore di costo</td>
			<td>Reagenti comuni di laboratorio (componenti del buffer TES, fenolo acido, cloroformio, isopropanolo, etanolo)</td>
			<td>TRI Reagent® commerciale, cloroformio o cloroformio:alcol isoamilico, isopropanolo, etanolo</td>
			<td>Colonne spin e tamponi proprietari di Qiagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIN</td>
			<td>8-10 RIN</td>
			<td>7,5-10 RIN</td>
			<td>9-10 RIN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Confronto tra costi, tempi e limitazioni nei tre diversi metodi di estrazione dell'RNA (metodo con fenolo caldo, metodo TRIzol e metodo RNeasy).
Figura supplementare 1: Ottimizzazione dell'estrazione di RNA. (A) Estrazione di RNA mediante fenolo caldo e lisi utilizzando un omogeneizzatore manuale per tessuti. (B) Estrazione di RNA mediante TRIzol. (C) Estrazione di RNA mediante il metodo RNeasy. (D) Analisi densitometrica delle immagini elettroforetiche di RNA estratto da Msmeg con diversi metodi. Le barre di errore rappresentano l'errore standard calcolato utilizzando GraphPad Prism (n = 8). (E) Estrazione di RNA mediante fenolo caldo dal ceppo Mtb. Tutte le immagini dei gel sono repliche biologiche indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S1.jpg" target="_blank">Cliccare qui per scaricare il file.</a>
Figura supplementare 2: (Pannello superiore) Analisi della curva di fusione di mysA, sigE e sigH da M. smeg, n = 3; (Pannello inferiore) Analisi dell'integrità dell'RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S2.jpg" target="_blank">Cliccare qui per scaricare il file.</a>

Questo studio ottimizza un metodo di estrazione dell'RNA basato sul fenolo caldo per Mycobacterium, producendo RNA di alta qualità adatto ad analisi trascrittomique. Confrontato con TRIzol e RNeasy in condizioni identiche, il metodo ha fornito un resa superiore, integrità comparabile e una maggiore efficienza economica, offrendo un'alternativa pratica per studi su larga scala dell'espressione genica.

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