Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto

Questa ricerca si concentra sullo sviluppo di un metodo affidabile, semplice ed economico per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto. La maggior parte degli studi sul pesce zebra non ha un modo semplice e affidabile per misurare la rottura della barriera emato-encefalica e i metodi esistenti sono spesso complessi o costosi. Quindi questo protocollo offre una soluzione pratica e conveniente.

Questo protocollo è semplice, economico e combina analisi visive e misurabili, il tutto senza la necessità di apparecchiature costose o passaggi complicati. Fornendo un protocollo semplice e riproducibile, renderà più facile per i laboratori esplorare i cambiamenti neurovascolari nei modelli di malattia del pesce zebra adulto. Per iniziare, anestetizza il pesce zebra abbassando gradualmente la temperatura dell'acqua da 12 gradi Celsius a sette gradi Celsius fino a quando il pesce non risponde più agli stimoli tattili.

Utilizzando una siringa da insulina calibro 31, iniettare 20 microlitri di blu Evans all'1%, o colorante EB, nella cavità intraperitoneale del pesce e applicare una leggera pressione nel sito di iniezione per 10 secondi per prevenire il riflusso. Ora trasferisci il pesce in una vasca di recupero e lascia che il recupero per 30 minuti. Monitora i pesci per lesioni, mortalità o cambiamenti comportamentali durante questo periodo.

Per stabilire un controllo positivo, preparare un ago sterile calibro 31 collegato a una siringa da insulina per eseguire una procedura di ferita da taglio. Dopo un periodo di recupero di 30 minuti, anestetizzare nuovamente il pesce, come dimostrato in precedenza. Posiziona il pesce in posizione verticale su una superficie piana e fredda, come un impacco di gel.

Inserire l'ago in un lato del cephalon con un angolo di 90 gradi a una profondità non superiore a 1,5 millimetri. Quindi trasferisci il pesce in una vasca di recupero e lascialo recuperare per 30 minuti. Dopo l'eutanasia del pesce per ipotermia, utilizzare una lama sterile o forbici chirurgiche per decapitare il pesce soppresso.

Sciacquare la testina due volte in 1X PBS utilizzando un rapporto 1:20 tra pesce e PBS per rimuovere il sangue in eccesso e il colorante blu di Evans. Quindi fissare la testa in paraformaldeide al 4% utilizzando un rapporto 1:20 tra pesce e fissativo e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Metti la testa fissa in una capsula di Petri pulita e seziona il cervello usando una pinzetta a punta.

Aggiungere continuamente PBS goccia a goccia durante la dissezione per mantenere il tessuto idratato e prevenire l'essiccazione. Sciacquare il cervello sezionato due volte in due bagni PBS separati e posizionare il tessuto su una piastra di agarosio all'1% per trattenere l'umidità e prevenire il restringimento. Osservare i tessuti cerebrali sezionati con uno stereomicroscopio.

Per iniziare l'analisi quantitativa, scarica e installa il software Fiji e apri il file dell'immagine del cervello in Fiji. Eseguire la deconvoluzione del colore selezionando Immagine, quindi Colore, Deconvoluzione del colore e scegliere RGB. Ciò si tradurrà in tre immagini separate che rappresentano le tonalità di rosso, verde e blu.

Ora, attiva l'immagine del canale blu, di solito etichettata Colore 3, facendo clic sull'immagine. Convertilo in scala di grigi a 8 bit selezionando Immagine, seguito da Tipo e 8 bit. Quindi, per misurare l'intensità del grigio dell'immagine a 8 bit, impostare i parametri di misurazione selezionando Analizza e Imposta misurazioni.

Quindi scegli l'area e il valore medio del grigio. Utilizzando lo strumento di selezione del rettangolo, disegna una regione di interesse di dimensioni uniformi e misura l'intensità del grigio selezionando Analizza, seguito da Misura. Il pesce zebra normale mostrava un tipico tono della pelle brunastro e il pesce zebra iniettato con EB mostrava una notevole tonalità bluastra.

Per studiare l'integrità della barriera emato-encefalica nel modello parkinsoniano adulto di zebrafish, è stato confrontato lo stravaso del colorante EB nei tessuti cerebrali tra il controllo iniettato con soluzione salina e il pesce zebra parkinsoniano. Nel gruppo di controllo negativo, i vasi sanguigni nel cervello apparivano rossastri, indicando l'assenza di stravaso del colorante EB. Al contrario, i gruppi di controllo iniettato con soluzione salina, controllo positivo e parkinsoniani hanno mostrato una colorazione bluastra nella vascolarizzazione cerebrale, confermando il successo della circolazione sistemica del colorante EB.

I cervelli sezionati del gruppo di controllo negativo apparivano biancastri con vasi sanguigni chiaramente visibili, confermando l'assenza di colorazione EB. Nel gruppo con lesione di controllo positivo, la colorazione blu intenso che circonda il tessuto cerebrale indicava una perdita di colorante dovuta a un'interruzione deliberata della barriera emato-encefalica. Nel gruppo iniettato con soluzione salina, la colorazione EB è rimasta confinata ai vasi sanguigni, indicando una barriera emato-encefalica intatta.

Il gruppo parkinsoniano ha mostrato un modello di colorazione blu più scuro e diffuso, indicando una significativa perdita di colorante EB e una compromissione della barriera emato-encefalica. L'analisi quantitativa della scala di grigi ha rivelato valori di intensità di grigio significativamente più bassi nel gruppo parkinsoniano rispetto al gruppo iniettato con soluzione salina.