Name: Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Scopri un metodo semplice ed economico per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto (Danio rerio) utilizzando il colorante blu di Evans. Questo protocolto consente analisi qualitative e quantitative delle alterazioni neurovascolari in modelli di malattia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo protocollo è stato seguito ed è stato autorizzato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università Islamica Internazionale della Malesia (IIUM), con riferimento all'approvazione dell'etica animale (rif. n.: IIUM/504/14/2/IACUC).
1. Preparare la soluzione madre del colorante Evans Blue
<ol>
	<li>Sciogliere 0,1 g di colorante EB in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x per preparare una soluzione madre all'1% (p/v). Mescolare accuratamente fino a quando il colorante non è completamente sciolto. ATTENZIONE: L'EB è classificato come cancerogeno di categoria 1B. Evitare il contatto diretto con la pelle e gli occhi. Utilizzare indumenti protettivi, guanti, occhiali di sicurezza e un respiratore antipolvere. Evitare di inalare la polvere e seguire le istruzioni per l'uso del produttore. Non gettare il colorante Evans Blue (solido o in soluzione) nel lavandino. Conservare i rifiuti nei contenitori originali etichettati. Smaltire secondo le normative nazionali e locali sui rifiuti pericolosi.</li>
	<li>Filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,45 μm. Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio e conservare a 4 °C. NOTA: È possibile utilizzare anche un filtro con pori di dimensioni inferiori (ad es. 0,2 μm). La soluzione madre può essere conservata a 4 °C per un massimo di due settimane o a -20 °C per un massimo di un mese, con l'aliquotazione consigliata per ridurre al minimo i ripetuti cicli di gelo-scongelamento quando conservata congelata.</li>
</ol>
2. Somministrare il colorante Evans Blue al pesce zebra adulto
<ol>
	<li>Anestetizzare il pesce zebra tramite shock ipotermico abbassando gradualmente la temperatura dell'acqua da 12 °C a 7 °C, fino a quando il pesce non risponde più agli stimoli tattili. NOTA: La riduzione graduale della temperatura può essere ottenuta aggiungendo piccole quantità di ghiaccio tritato all'acqua lentamente per diversi minuti, consentendo alla temperatura di diminuire progressivamente. L'immersione nella tricaina è anche un metodo anestetico alternativo adatto.</li>
	<li>Iniettare 20 μl di colorante EB all'1% nella cavità intraperitoneale (IP) utilizzando una siringa da insulina da 31 G. Applicare una leggera pressione nel sito di iniezione per 10 s per evitare il riflusso. NOTA: La cavità intraperitoneale del pesce zebra si trova posteriormente al cingolo pelvico. Per aumentare il tasso di successo della somministrazione di EB, digiunare il pesce per 24 ore prima dell'iniezione. Questo svuoterà la cavità addominale per fornire un migliore accesso e precisione allo spazio intraperitoneale.</li>
	<li>Trasferire il pesce in una vasca di recupero e lasciare che il recupero per 30 minuti. Monitorare la presenza di lesioni, mortalità o cambiamenti comportamentali. NOTA: Per aiutare il pesce zebra a riprendersi, utilizzare una temperatura dell'acqua leggermente ridotta (20-24 °C) per la vasca di recupero per fornire un lieve effetto anestetico e aiutare a intorpidire il potenziale disagio post-iniezione. Il pesce iniettato mostrerà una tonalità blu, che indica una corretta circolazione del colorante (Figura 1).</li>
	<li>Dopo 30 minuti, sopprimere il pesce tramite shock ipotermico a 1-3 °C. Quindi, decapita il pesce usando una lama sterile o forbici chirurgiche. NOTA: Per facilitare la dissezione cerebrale in seguito, lasciare della carne extra dietro la testa durante la decapitazione.</li>
	<li>Sciacquare la testina due volte in 1x PBS (rapporto pesce/PBS 1:20) per rimuovere il sangue in eccesso e il colorante EB. NOTA: Un lavaggio insufficiente può portare a risultati falsi positivi e compromettere l'accuratezza dell'analisi. Per evitare ciò, lavare accuratamente il tessuto cerebrale almeno due volte con 1x PBS, assicurandosi che tutto il sangue visibile e il colorante a flusso libero vengano rimossi. Se rimane qualche residuo di colorante, si consiglia vivamente un terzo lavaggio.</li>
	<li>Fissare la testa in paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 °C per una notte (rapporto pesce/fissativo 1:20). Non è necessaria l'agitazione durante la fissazione, poiché le dimensioni ridotte della testa del pesce zebra e il volume di fissazione sufficiente consentono una penetrazione efficace in condizioni statiche. ATTENZIONE: Il PFA è dannoso se ingerito, inalato o a contatto con la pelle. Preparare la soluzione di PFA sotto una cappa aspirante. Utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati ed evitare l'inalazione di polvere. Seguire tutte le linee guida di sicurezza del produttore. Trattare i PFA come rifiuti pericolosi. Evitare di gettarlo nello scarico. Raccogliere ed etichettare i rifiuti in contenitori sigillati e smaltirli in conformità con le normative locali e nazionali.</li>
	<li>Sezionare il cervello del pesce zebra<ol>
		<li>Posizionare la testa fissa in una capsula di Petri pulita e sezionare il cervello come descritto in precedenza15, utilizzando una pinzetta a punta. Aggiungere continuamente 1x PBS goccia a goccia durante la dissezione per mantenere il tessuto idratato e prevenire l'essiccazione.</li>
		<li>Preparare la piastra di agarosio sciogliendo 1 g di agarosio in 100 ml di acqua distillata. Cuocetelo nel microonde fino a completo scioglimento, versatelo in una capsula di Petri e lasciatelo solidificare.</li>
		<li>Sciacquare il cervello sezionato due volte in due bagni PBS separati. Quindi, posizionare il tessuto su una piastra di agarosio all'1% per trattenere l'umidità e prevenire il restringimento. NOTA: Un lavaggio insufficiente può portare a risultati falsi positivi e compromettere l'accuratezza dell'analisi. Per evitare ciò, lavare accuratamente il tessuto cerebrale almeno due volte con 1× PBS, assicurandosi che tutto il sangue visibile e il colorante a flusso libero vengano rimossi. Se rimane qualche residuo di colorante, si consiglia vivamente un terzo lavaggio.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69010/69010fig1.jpg"> 
Figura 1: Confronto della colorazione della pelle tra un pesce zebra normale e uno iniettato con EB. (A) Pesce zebra normale che mostra un tipico tono della pelle brunastro. (B) Zebrafish iniettato con EB che mostra una notevole tonalità bluastra, che indica una corretta circolazione sistemica del colorante. Barra della scala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69010/69010fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. Stabilire un controllo positivo tramite la ferita da taglio (SWI)
NOTA: La ferita da taglio rompe la BBB e consente lo stravaso di EB nel sito della lesione.
<ol>
	<li>Anestetizzare il pesce con il metodo dello shock ipotermico (vedi passaggio 2.1). Una volta anestetizzato, iniettare 20 μl di colorante EB all'1% e lasciare che il pesce si riprenda per 30 minuti come descritto nei passaggi 2.2 e 2.3.</li>
	<li>Dopo un periodo di recupero di 30 minuti, preparare un ago sterile da 31 G collegato a una siringa da insulina ed eseguire una procedura di ferita da taglio come segue:<ol>
		<li>Anestetizzare nuovamente il pesce.</li>
		<li>Posizionare il pesce in posizione verticale su una superficie piana e fredda (ad es. impacco di gel di ghiaccio). Inserire l'ago in un lato del telencefalo con un angolo di 90° a una profondità non superiore a 1,5 mm (Figura 2). NOTA: Per evitare il contatto diretto della pelle con l'impacco di gel di ghiaccio ed evitare potenziali danni alla pelle, posizionare uno strato di garza o tovagliolo di carta tra il pesce e la superficie fredda (Figura 2). In alternativa, il pesce può essere posizionato in una capsula di Petri poco profonda posizionata sopra l'impacco freddo per mantenere il raffreddamento senza contatto diretto. Segnare 1,5 mm sull'ago per evitare una penetrazione eccessiva.</li>
		<li>Trasferire il pesce in una vasca di recupero e lasciarlo recuperare per 30 minuti.</li>
		<li>Eutanasia, decapitare, fissare e sezionare il cervello come descritto nei passaggi da 2.4 a 2.7.</li>
		<li>Per il controllo negativo, ripetere i passaggi da 2.1 a 2.7 utilizzando 20 μl di 1x PBS invece del colorante EB.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69010/69010fig2.jpg"> 
Figura 2: Ferita da taglio per il controllo positivo. (A) Inserire brevemente un ago 31G nel telencefalo (cerchio rosso) per facilitare la penetrazione del colorante EB nel tessuto cerebrale; Confronto fianco a fianco di un cervello non danneggiato e di un cervello pugnalato, (B) vista dorsale del sito della pugnalata (cerchio rosso), (C) vista laterale del sito della pugnalata. Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69010/69010fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. Analisi qualitativa dello stravaso di EB
<ol>
	<li>Osservare i tessuti cerebrali sezionati con uno stereomicroscopio. Ottimizza le impostazioni dell'immagine (zoom, bilanciamento del bianco, esposizione, contrasto, ecc.) per garantire la coerenza.</li>
	<li>Acquisisci immagini utilizzando una fotocamera montata sul microscopio e salvale in formato . Formato TIFF. NOTA: Utilizzare impostazioni di imaging identiche per tutti i campioni per garantire la validità comparativa.</li>
</ol>
5. Analisi quantitativa dello stravaso di EB
<ol>
	<li>Scarica e installa Fiji (un link per scaricare il software è disponibile nella Tabella dei materiali). Apri l'immagine nelle Figi.</li>
	<li>Esegui la deconvoluzione del colore facendo clic su: Immagine &gt; Colore &gt; Deconvoluzione del colore &gt; RGB, ottenendo tre immagini separate che rappresentano le tonalità di rosso, verde e blu. NOTA: Questo passaggio isola la tonalità blu dalle altre componenti del colore, assicurando che venga misurata solo l'intensità del colorante blu.</li>
	<li>Attiva l'immagine blu del canale (solitamente etichettata "Color_3") facendo clic sull'immagine. Convertilo in scala di grigi a 8 bit facendo clic su: Tipo di &gt; immagine &gt; 8 bit. NOTA: La conversione della scala di grigi riduce al minimo gli artefatti cromatici e migliora l'analisi basata sull'intensità.</li>
	<li>Misura l'intensità del grigio dell'immagine a 8 bit.<ol>
		<li>Impostare le misurazioni selezionando: Analizza &gt; Imposta misurazioni; selezionare Area e Valore medio di grigio.</li>
		<li>Utilizzando lo strumento di selezione del rettangolo, disegna una regione di interesse (ROI) di dimensioni uniformi e misura l'intensità del grigio selezionando Analizza &gt; misura o premendo Ctrl + M. NOTA: La stessa dimensione del ROI deve essere utilizzata per tutti i campioni. Le dimensioni assolute del ROI possono variare a seconda dell'ingrandimento e della risoluzione dell'immagine acquisita, quindi i ricercatori dovrebbero standardizzare le dimensioni del ROI all'interno del loro set di dati per garantire la comparabilità. Ogni pixel nell'immagine in scala di grigi a 8 bit ha un valore di intensità compreso tra 0 e 255, dove 0 rappresenta il nero puro, 255 rappresenta il bianco puro e i valori intermedi rappresentano varie tonalità di grigio.</li>
		<li>Per ridurre la distorsione, disegnare da tre a cinque ROI all'interno di regioni anatomicamente coerenti del cervello in tutti i campioni. Evitare le regioni con artefatti o macchie incoerenti. NOTA: La coerenza del posizionamento può essere ottenuta facendo riferimento ai punti di riferimento anatomici e garantendo che il posizionamento del ROI sia simmetrico tra i gruppi sperimentali.</li>
		<li>Fare la media dei valori di grigio a partire dai ROI per ogni immagine per ottenere un singolo valore di intensità per cervello. Utilizzare questa media per il confronto statistico tra i gruppi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-brain+barrier+overview+on+structure%2C+function%2C+impairment%2C+and+biomarkers+of+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids Barriers CNS. 17, 1-24 (2020).</li>
<li>Knox, E. G., Aburto, M. R., Clarke, G., Cryan, J. F., O'Driscoll, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+aging+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in aging and neurodegeneration.</a> Mol Psychiatry. 27 (6), 2659-2673 (2022).</li>
<li>Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+Alzheimer+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders.</a> Nat Rev Neurol. 14 (3), 133-150 (2018).</li>
<li>Kim, S., Jung, U. J., Kim, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crucial+role+of+the+blood-brain+barrier+in+neurodegenerative+diseases%3A+Mechanisms+of+disruption+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">The crucial role of the blood-brain barrier in neurodegenerative diseases: Mechanisms of disruption and therapeutic implications.</a> J Clin Med. 14 (2), 386(2025).</li>
<li>Guarino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+modelling+human+blood-brain+barrier+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Advancements in modelling human blood-brain barrier on a chip.</a> Biofabrication. 15 (2), 022003(2023).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends Pharmacol Sci. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Eliceiri, B. P., Gonzalez, A. M., Baird, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEliceiri%2C+BP+%22The+blood-brain+and+other+neural+barriers%3A+reviews+and+protocols%22">The blood-brain and other neural barriers: reviews and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2010).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+promising+in+vivo+model+for+assessing+the+delivery+of+natural+products%2C+fluorescence+dyes+and+drugs+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A promising in vivo model for assessing the delivery of natural products, fluorescence dyes and drugs across the blood-brain barrier.</a> Pharmacol Res. 125, 246-257 (2017).</li>
<li>Fleming, A., Diekmann, H., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterisation+of+the+maturation+of+the+blood-brain+barrier+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional characterisation of the maturation of the blood-brain barrier in larval zebrafish.</a> PLoS One. 8 (10), e77548(2013).</li>
<li>Kislyuk, S., van den Bosch, W., Adams, E., De Witte, P., Cabooter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+and+quantitative+capillary+LC-UV+method+to+study+the+uptake+of+pharmaceuticals+in+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive and quantitative capillary LC-UV method to study the uptake of pharmaceuticals in zebrafish brain.</a> Anal Bioanal Chem. 410, 2751-2764 (2018).</li>
<li>Jaffer, H., Adjei, I. M., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+to+map+blood-brain+barrier+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optical imaging to map blood-brain barrier leakage.</a> Sci Rep. 3 (1), 3117(2013).</li>
<li>Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+blue+dye%3A+A+revisit+of+its+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evans blue dye: A revisit of its applications in biomedicine.</a> Contrast Media Mol Imaging. 2018 (1), 7628037(2018).</li>
<li>Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Evans+blue+dye+to+determine+blood-brain+barrier+integrity+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents.</a> Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83(2019).</li>
<li>Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+adult+zebrafish+model+of+Parkinson%27s+disease%3A+a+systematic+review+of+dynamic+changes+in+behavior+and+physiology+post-MPTP+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration.</a> Front Neurosci. 18, 1432102(2024).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> J Vis Exp. (108), e53617(2016).</li>
<li>Al-Bachari, S., Naish, J. H., Parker, G. J., Emsley, H. C., Parkes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+leakage+is+increased+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier leakage is increased in Parkinson's disease.</a> Front Physiol. 11, 593026(2020).</li>
<li>Gray, M. T., Woulfe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+blood-brain+barrier+permeability+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Striatal blood-brain barrier permeability in Parkinson's disease.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 747-750 (2015).</li>
<li>Hourfar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+%CE%B1-synuclein+aggregates+on+blood-brain+barrier+integrity+in+the+presence+of+neurovascular+unit+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">The impact of α-synuclein aggregates on blood-brain barrier integrity in the presence of neurovascular unit cells.</a> Int J Biol Macromol. 229, 305-320 (2023).</li>
<li>Olmedo-Díaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+altered+blood-brain+barrier+contributes+to+brain+iron+accumulation+and+neuroinflammation+in+the+6-OHDA+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An altered blood-brain barrier contributes to brain iron accumulation and neuroinflammation in the 6-OHDA rat model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 362, 141-151 (2017).</li>
<li>Ravenstijn, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+blood-brain+barrier+transport+and+CNS+drug+metabolism+in+diseased+and+control+brain+after+intravenous+L-dopa+in+a+unilateral+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Evaluation of blood-brain barrier transport and CNS drug metabolism in diseased and control brain after intravenous L-dopa in a unilateral rat model of Parkinson's disease.</a> Fluids Barriers CNS. 9, 1-14 (2012).</li>
<li>Wu, Y. C., Sonninen, T. M., Peltonen, S., Koistinaho, J., Lehtonen, Š <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+and+neurodegenerative+diseases-modeling+with+iPSC-derived+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier and neurodegenerative diseases-modeling with iPSC-derived brain cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (14), 7710(2021).</li>
<li>Hosseini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+phenotypic+sex+classification+of+zebrafish+using+machine+learning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Efficient phenotypic sex classification of zebrafish using machine learning methods.</a> Ecol Evol. 9 (23), 13332-13343 (2019).</li>
<li>Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+requirement+of+tight+junction+proteins+in+blood-brain+barrier+function+and+their+role+in+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies.</a> Int J Mol Sci. 25 (11), 5601(2024).</li>
<li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+into+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection into adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (42), e2126(2010).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+indoline+derivative+for+in+vivo+fluorescent+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel indoline derivative for in vivo fluorescent imaging of blood-brain barrier disruption in animal models.</a> ACS Chem Neurosci. 4 (8), 1183-1193 (2013).</li>
<li>Schoknecht, K., Eilers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-to-blood+transport+of+fluorescein+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Brain-to-blood transport of fluorescein in vitro.</a> Sci Rep. 14 (1), 25572(2024).</li>
<li>Harris, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+methods+for+imaging+blood-brain+barrier+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo methods for imaging blood-brain barrier function and dysfunction.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 50 (4), 1051-1083 (2023).</li>
<li>Hamilton, N., Allen, C., Reynolds, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+MRI+brain+studies+in+live+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Longitudinal MRI brain studies in live adult zebrafish.</a> NMR Biomed. 36 (7), e4891(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarosio in polvere</td><td>Vivantis</td><td>PC0701</td><td></td></tr><tr><td>La tintura blu di Evan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Figi ImageJ</td><td>Istituti Nazionali di Sanità, Stati Uniti</td><td></td><td>Link per scaricare: https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Fotocamera per microscopio</td><td>Fornitore verificato - ShenZhen Hayear Electronics Co., Ltd.</td><td>HY-500M</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA) in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Prodotti chimici HmbG</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Società Olimpo</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtro siringa, 0,45&micro; m</td><td>Merck Millipore&nbsp;</td><td>SLHV004SL</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzare il guardiano: la valutazione di evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto

Visualizing the Gatekeeper: Evan's Blue Dye-Based Assessment of Blood-Brain Barrier Permeability in Adult Zebrafish

Questo protocollo è stato testato su un modello di zebrafish parkinsoniano. La compromissione della BBB è un fenomeno ben documentato nei pazienti con PD 16,17,18 e in vari modelli animali parkinsoniani 19,20,21. Per studiare l'integrità della BBB nel modello parkinsoniano adulto di zebrafish, lo stravaso del colorante EB nei tessuti ce...

Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto

The Blood-Brain Barrier (BBB) is a semi-permeable interface that maintains central nervous system (CNS) homeostasis by regulating the movement of ...

visualizing-gatekeeper-evan-s-blue-dye-based-assessment-blood-brain

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Descriviamo un animale vivo misurazione quantitativa per tutta la permeabilità del cervello zebrafish embrionale. La tecnica analizza la capacità di mantenere fluido cerebrospinale e molecole di differenti pesi molecolari all'interno del lume del tubo neurale e quantifica loro movimento fuori dei ventricoli. Questo metodo è utile per determinare differenze di permeabilità epiteliale e maturazione durante lo sviluppo e la malattia.

Un saggio per permeabilità del neuroepitelio Zebrafish embrionali

Presentiamo un nuovo metodo di microsonda gastrica per i pesci zebra larvali che utilizza attrezzature standard per microiniezioni di embrioni e stereomicroscopia. Dimostriamo che la microsonda gastrica è una tecnica sicura ed efficiente, utile per somministrare quantità controllate di diversi materiali direttamente nella cavità intestinale delle larve di pesce zebra.

Microgavage di larve Zebrafish

Questo video mostra una procedura per valutare l'interruzione della barriera emato-encefalica in un modello murino EAE. Coloranti fluorescenti di diverse dimensioni vengono iniettati per via retro-orbitale e circolano attraverso i vasi sanguigni del cervello. Il colorante più piccolo fuoriesce attraverso le fessure nel tessuto cerebrale, mentre il colorante più grande entra solo se l'interruzione è grave, correlata all'entità del danno alla barriera.

Determinazione dell'interruzione della barriera emato-encefalica utilizzando coloranti fluorescenti in un modello murino EAE

Emato-encefalica perturbazione barriera favorisce l'erogazione di alcuni farmaci al cervello. Mannitolo consegnato intra-arteriosa cellule restringe i vasi sanguigni circostanti, al fine di distruggere fisicamente la barriera.

Modello Rat di emato-encefalica Turbativa Barriera per consentire mirato Therapeutics neurovascolare

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

L'integrità della barriera emato-encefalica è fondamentale per la funzione del sistema nervoso. Nella Drosophila melanogaster, la barriera emato-encefalica è formata da cellule gliali durante l'embriogenesi tardiva. Questo protocollo descrive i metodi per la formazione e la manutenzione delle barriere emato-encefalice negli embrioni di D. melanogaster e delle larve instar terze.

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Qui presentiamo un metodo per immaginare il cervello embrionale del pesce zebra in vivo fino agli stadi larvale e giovanile. Questa procedura microinvasiva, adattata da approcci elettrofisiologici, fornisce l'accesso ai dettagli cellulari e subcellulari del neurone maturo e può essere combinata con studi optogenetici e neurofarmacologici per caratterizzare la funzione cerebrale e l'intervento farmacologico.

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Questo protocollo dimostra la microiniezione di lipopolisaccaride nella regione ventricolare del cervello in un modello larvale di zebrafish per studiare la risposta neuroinfiammatoria risultante e la neurotossicità.

Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità

Viene presentato un protocollo per valutare se le piccole vescicole extracellulari (sEV) isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la barriera emato-encefalica in topi femmine adulte non gravide.

Rottura della barriera emato-encefalica del topo da piccole vescicole extracellulari da placente umane ipossiche

È stato sviluppato un metodo per visualizzare lo stravaso di colorante dovuto alla rottura della barriera emato-encefalica (BEE) somministrando due coloranti fluorescenti ai topi in momenti diversi. L'uso del glicerolo come crioprotettore ha facilitato l'immunoistochimica sullo stesso campione.

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Scopri un metodo semplice ed economico per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto (Danio rerio) utilizzando il colorante blu di Evans. Questo protocolto consente analisi qualitative e quantitative delle alterazioni neurovascolari in modelli di malattia.

Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto (Video) | JoVE Journal

Visualizzare il guardiano: la valutazione di Evan basata sul colorante blu della permeabilità della barriera emato-encefalica nel pesce zebra adulto

Esplora altri video