Mutagenesi precisa dei fagi con i sistemi CRISPR-Cas assistiti da NgTET

Studiamo l'infezione da fagi a livello molecolare. Questa è davvero una scienza fondamentale. Tuttavia, non stiamo solo facendo scienza fondamentale, siamo anche desiderosi di tradurre questa scienza fondamentale in applicazioni in cui utilizziamo questa conoscenza per studiare l'infezione da fagi e per utilizzarla per l'ingegneria fagica e per applicazioni terapeutiche.

Uno degli sviluppi più recenti nel campo della ricerca sui fagi è la scoperta di un sistema immunitario batterico. Questo sistema immunitario è presente in tutti i batteri e hanno identificato o generato strumenti per combattere davvero il fago. Tuttavia, il fago è piuttosto intelligente.

Un fago è stato in grado di identificare anche gli strumenti e di sviluppare strumenti che gli permettono di sfuggire a quei sistemi immunitari. E uno strumento è in realtà la modifica del suo DNA attraverso la modifica. E questo è soprattutto per noi, davvero interessante perché studiare la natura chimica di queste modificazioni del DNA che i fagi hanno generato per sfuggire al sistema immunitario è davvero interessante, e ci permette anche di diventare uno strumento per ingegnerizzare il fago alla fine.

Negli ultimi 10 anni, grandi colleghi di tutto il mondo hanno sviluppato tecnologie meravigliose. Una di queste tecnologie è, ad esempio, il sequenziamento di nuova generazione. Sulla base di questa tecnologia, possiamo davvero sequenziare i fagi, ma anche l'intero genoma dell'ospite a livello molecolare.

D'altra parte, è stata sviluppata la spettrometria di massa, qualcosa di simile alla proteomica. CRISPR è uno strumento meraviglioso che ora viene applicato in vari regni della vita. E lo stiamo usando anche ora per ingegnerizzare il genoma del fago.

Queste sono solo alcune delle meravigliose tecnologie che hanno rimodellato il modo in cui pensiamo ai fagi oggi. Quando parliamo delle sfide attuali, una delle sfide che vediamo è l'ingegnerizzazione del bio CRISPR di un genoma fagico. Il genoma del fago è totalmente modificato con modifiche del DNA e gli ACE nucleari CRISPR non sono in grado di scindere il DNA.

Quindi questa è davvero una sfida che dobbiamo superare se vogliamo ingegnerizzare i genomi dei fagi batterici. Il mio gruppo ha scoperto un elemento costitutivo totalmente nuovo degli RNA. Abbiamo scoperto che specifici trascritti trasportano al loro quinto capolinea, il cosiddetto spettro redox, nicotinammide adenina dinucleotide short NAD, e lo abbiamo scoperto anche di recente per la prima volta nelle interazioni tra fagi T4 di E-coli.

Sulla base di questa scoperta, abbiamo anche identificato che gli RNA e le proteine possono interagire tra loro in un modo totalmente nuovo. Abbiamo scoperto che questo NAD che ho descritto prima funziona come una colla molecolare per collegare tra loro RNA e proteine. Questa euforia dell'RNA è un modo totalmente nuovo di come gli RNA e le proteine interagiscono tra loro in natura.

E abbiamo fatto questa scoperta nell'interazione eco anti fagi. Ora siamo anche desiderosi di tradurre questa scienza fondamentale in applicazioni, ad esempio, nel campo delle terapie basate sull'RNA. Per iniziare, trattare 500 microlitri di sospensione fagica con 20 unità di DNA 1.

Aggiungere due microlitri di RNA AT1 miscelati alla provetta. Incubare la miscela trattata a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, caricare 500 microlitri della soluzione fagica trattata sopra un gradiente di saccarosio preparato.

Centrifugare il gradiente a 70.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Accendere la provetta da centrifugazione dal basso per visualizzare la banda torbida dei fagi nel gradiente. Quindi, con una cannula smussata, rimuovere con cautela la frazione contenente il fago in una nuova provetta per ultraultracentrifugazione.

A questo punto, aggiungere 30 millilitri di tampone TM ghiacciato alla provetta e centrifugare. Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone TM dopo aver scartato il surnatante. Conservare i fagi risospesi in una fiala di vetro a quattro gradi Celsius durante la notte.

Aggiungere un microgrammo di proteinasi K ai fagi risospesi. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere al campione un volume uguale di cloroformio fenolo, miscela di alcol isoamilico.

Capovolgere per mescolare bene e centrifugare. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta di reazione e ripetere l'estrazione tre volte. Eseguire tre estrazioni posteriori di cloroformio utilizzando un volume uguale di cloroformio per rimuovere il fenolo residuo.

Quindi precipitare il DNA aggiungendo 0,1 volumi di acetato di sodio a tre molari a PH 5,5 e 2,5 volumi di etanolo. Incubare la miscela per una notte a meno 20 gradi Celsius. Il giorno successivo, centrifugare il campione a 15.000 G per un'ora a quattro gradi Celsius per pellettare il DNA.

Lavare due volte il pellet di DNA con 200 microlitri di etanolo al 70%. Agitare delicatamente la provetta e centrifugare di nuovo. Rimuovere con cautela il surnatante.

Quindi risucchiare, sospendere il DNA purificato in acqua ultrapura. Conservare il DNA a meno 20 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Inoculare le cellule di Escherichia coli BL 21D 3 che vengono trasformate sia con il plasmide PET 28 NGTet, sia con un plasmide di espressione CAS 12 o CAS 9.

Coltivare la coltura in terreno LB con l'aggiunta di antibiotici appropriati a 37 gradi Celsius con agitazione. Indurre l'espressione di NG TED aggiungendo 0,05 millimolari di IPTG e incubare per altre due ore a 37 gradi Celsius. Come controllo, confrontare i ceppi di E.coli BL 21 D3 con e senza sovraespressione di NgTET.

Trasferire 300 microlitri di colture di E.coli in una provetta sterile. Infettare la coltura con fago T4 wild type o trattato con NgTET a una molteplicità di infezioni di 0,01. Mescolare delicatamente per garantire una distribuzione uniforme dei fagi, quindi incubare di nuovo.

Aggiungere la miscela di batteri fagi a quattro millilitri di coclea morbida LB contenente lo 0,75% di coclea e antibiotici. Mescolare accuratamente, ma delicatamente per evitare la formazione di bolle. Versare il composto morbido della coclea su una piastra della coclea LB preriscaldata.

Lasciare solidificare brevemente la piastra a temperatura ambiente e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, contare le placche per determinare il numero di unità di formazione della placca. Per la selezione del contatore, infettare il distanziatore E.coli cast 13 A utilizzando i fagi da selezionare con il contatore.

Eseguire la selezione del contatore nelle stesse condizioni utilizzate per la mutagenesi. Dopo l'incubazione, filtrare il natante SUP attraverso un filtro da 0,45 micrometri per rimuovere i detriti batterici. Utilizzare il contatore di fagi selezionati e filtrati per un test di placca su un ceppo di E.coli B per isolare le singole placche per la convalida a valle.

La banda dei fagi era chiaramente visibile quando il campione di fago T4 era sufficientemente concentrato. L'espressione della proteina NgTET in E.coli è stata confermata dal fago SDS che ne ha mostrato la presenza sia nella frazione solubile che in quella insolubile dopo lisi cellulare e centrifugazione. I cromatogrammi hanno mostrato che le abbondanze relative di dioxiadenosina, diiodoidrossichinolina e timidina erano invariate tra il DNA del fago T4 wild type e quello del fago T4 trattato con NgTET.

L'abbondanza di derivati della citosina modificati è risultata significativamente ridotta nel DNA del fago trattato con NgTET rispetto al campione non trattato. Un plasmide contenente il gene NgTET e regioni di omologia per la mutagenesi mirata è stato costruito utilizzando il clonaggio golden gate. Lo screening PCR ha confermato il successo dell'amplificazione del gene target nella corsia da due a nove del gel agros, indicando risultati positivi tra le placche raccolte.

Nel DNA del fago T4 wild type, l'abbondanza relativa di 5 glicosilidrossietil2 prime deoxidina era elevata. Nel DNA del fago T4 trattato con NgTET, i livelli di 5 glicosilidrossietil2 prime deoxidina erano fortemente ridotti rispetto al wild type. Il DNA del fago T4 trattato con il mutante catalitico inattivo NgTET D234 A ha mantenuto alti livelli di 5 glicolidrossietil2 prime deossidadina.

La progenie del fago T 4 recuperata ha mostrato livelli quasi ripristinati di 5 idrossimetil2 prima deossidina rispetto al tipo selvatico.