Name: Mutagenesi precisa dei fagi con i sistemi CRISPR-Cas assistiti da NgTET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Scopri la mutagenesi CRISPR-Cas senza cicatrici nei batteriofagi usando l'enzima NgTET. Questo metodo avanzato riduce le modifiche del DNA e migliora l'ingegneria genetica dei fagi per applicazioni in biotecnologia e terapia fagica.

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<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
<li>Adler, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+CRISPR-Cas13a+enables+efficient+phage+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing.</a> Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).</li>
<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

I batteriofagi sono virus che prendono di mira specificamente i batteri. Hanno suscitato un notevole interesse da parte della ricerca grazie al loro immenso potenziale nella biotecnologia e nella medicina, in particolare nella lotta contro i batteri multiresistenti 1,2,3. Nonostante ciò, la biologia dei fagi rimane relativamente poco studiata. Una comprensione più profonda dei loro meccanismi molecolari di dirottamento dei loro ospiti batterici è essenziale per sfruttare appieno il loro potenziale terapeutico e biotecnologico4. Per studiare i meccanismi molecolari alla base dell'efficiente infezione dei fagi e per ingegnerizzare ulteriormente i fagi per applicazioni specifiche, è essenziale la capacità di modificare geneticamente i genomi dei fagi. Eppure rimane una delle sfide più significative nel campo della biologia dei fagi 3,5,6.
Il DNA dei fagi è spesso modificato da specifiche alterazioni chimiche delle basi purine e pirimidiniche, ad esempio la glicosilazione e la metilazione della citosina. Queste modifiche proteggono il materiale genetico dei fagi dal riconoscimento e dalla degradazione da parte delle nucleasi dell'ospite6. Sebbene queste modifiche siano cruciali per l'idoneità dei fagi, sono un ostacolo significativo per gli approcci di ingegneria del genoma dei fagi che si basano su sistemi di targeting del DNA 2,3,7.
Le strategie di mutagenesi esistenti, compresi i sistemi di modificazione della restrizione e le tecnologie basate sulle proteine CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-CAS (CRISPR), affrontano sfide significative quando modificano il DNA dei fagi a causa di modifiche epigenetiche protettive come la glicosilazione della citosina8. L'editing genomico mediato da CRISPR-Cas, che è altamente efficace nelle cellule batteriche ed eucariotiche, si basa su due passaggi chiave: la scissione precisa del DNA nei loci genomici mirati da parte della Cas nucleasi, seguita dalla riparazione del DNA attraverso la ricombinazione omologa con il DNA del donatore portatore della mutazione desiderata1. Tuttavia, nei fagi, le modifiche del DNA spesso impediscono alle nucleasi Cas di legarsi o scindere il genoma in modo efficiente. Inoltre, la natura rapida e transitoria della replicazione dei fagi può limitare ulteriormente l'efficienza della ricombinazione omologa. Queste barriere rendono particolarmente difficile l'applicazione della tecnologia CRISPR-Cas mirata al DNA per la mutagenesi dei fagi. È stato dimostrato che le modifiche del DNA fagico compromettono il targeting del DNA fagico con CRISPR-Cas sia in vitro che in vivo 6,7.
Per affrontare le sfide poste dalle modificazioni protettive del DNA nei fagi, introduciamo una strategia di mutagenesi del genoma che sfrutta l'attività della metilcitosina diossigenasi dieci-undici (TET), in particolare NgTET. Negli eucarioti, gli enzimi TET catalizzano l'ossidazione graduale della citosina metilata attraverso processi iterativi: la metilcitosina (5mdC) viene prima convertita in idrossimetilcitosina (5hmdC), poi in formilcitosina (5fdC) e infine in carbossicitosina (5cadC) (Figura 1).
Nel nostro approccio alla mutagenesi dei fagi, NgTET viene utilizzato per ridurre temporaneamente l'abbondanza di modifiche protettive del DNA, migliorando così l'accessibilità del DNA dei fagi agli strumenti di editing del genoma come gli enzimi Cas9. NgTET, è stato selezionato per modulare il genoma del batteriofago a causa di precedenti rapporti sulla sua espressione di successo in forma solubile attiva in un ospite batterico eterologo, in particolare E. coli. Questa proprietà è essenziale, poiché NgTET deve rimanere attivo durante l'infezione da fagi10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Ossidazione graduale della 5-metilcitosina da parte della TET diossigenasi1. La TET diossigenasi catalizza la successiva ossidazione della 5-metil-2'-deossicitidina (5mdC) a 5hmdC, 5-formil-2'-deossicitidina (5fdC) e infine a 5-carbossil-2'-deossicitidina (5cadC). Il prodotto finale, 5cadC, ritorna spontaneamente o enzimaticamente alla citosina non modificata (dC), contribuendo così alla regolazione epigenetica dinamica. Questo processo in più fasi è fondamentale per la metilazione attiva del DNA negli eucarioti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Poiché la metilcitosina e l'idrossimetilcitosina sono precursori comuni delle ipermodificazioni del DNA dei fagi, comprese le strutture protettive ingombranti come le glicosilazioni, l'attività ossidativa della TET diossigenasi può essere sfruttata per prevenire la formazione di queste ipermodificazioni del DNA9. In questo approccio di mutagenesi del genoma basato su TET, esprimiamo eterologamente NgTET in modo ricombinante in E. coli per ossidare le citosine idrossimetilate nel genoma del fago dopo l'infezione, prevenendo così la formazione di glicosilazione bulky. Diminuendo l'abbondanza di queste ingombranti modificazioni del DNA, il nostro approccio può aumentare l'accessibilità del DNA dei fagi alle nucleasi CRISPR-Cas. Questa maggiore accessibilità facilita il riconoscimento efficiente del bersaglio, la scissione precisa del DNA e l'introduzione di mutazioni puntiformi senza cicatrici nel genoma del fago, distinguendolo dai tradizionali metodi di mutagenesi dei fagi che si basano su delezioni geniche, inserzioni di geni reporter o l'integrazione di giunzioni artificiali per la selezione dei mutanti basata sulla PCR 1,11. Queste strategie convenzionali sono state finora gli unici strumenti disponibili per la mutagenesi mirata nei genomi dei fagi e rappresentano quindi una base importante per il metodo qui presentato. Tuttavia, le proteine dei singoli fagi possono possedere molteplici funzioni. La delezione dell'intero gene che codifica per una proteina di interesse interrompe tutte le funzioni associate. Al contrario, l'introduzione mirata di mutazioni puntiformi consente l'inattivazione selettiva di funzioni specifiche, consentendo un'analisi dettagliata dei loro ruoli. Ad oggi, le funzioni di molte proteine fagiche rimangono in gran parte non caratterizzate; Pertanto, potremmo trascurare ulteriori attività legate a un determinato gene. Pertanto, è preferibile un approccio minimalista che mira a rimuovere solo una singola funzione causando cambiamenti minimi alla proteina complessiva 12,13. Il metodo qui descritto consente di apportare modifiche genetiche precise senza interrompere l'organizzazione o la funzione genomica complessiva. Un'altra grande sfida dei precedenti metodi di mutagenesi dei fagi è stata la loro bassa efficienza, che in genere ha prodotto tassi di mutazione di circa lo 0,1%1,11. Con questa tecnica, presentiamo la prima strategia di mutagenesi in grado di introdurre cambiamenti a singolo codone, ottenendo un notevole aumento di sette volte dell'efficienza del targeting. Combinandolo con un metodo di screening ad alto rendimento basato su ONT, il rilevamento delle mutazioni puntiformi è semplificato, eliminando la necessità di sottoporre a screening grandi popolazioni di fagi per isolare un mutante. La strategia di mutagenesi basata su TET qui descritta affronta una limitazione di lunga data nel campo e consente un editing genomico più affidabile14.
Nel complesso, questo metodo non può essere applicato solo per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi di infezione da batteriofagi, ma è anche molto promettente per la biologia sintetica. Consentendo un'ingegneria precisa ed efficiente del genoma dei fagi, apre la strada all'adattamento dei fagi ad applicazioni specifiche, migliorando così il loro potenziale per applicazioni biotecnologiche e mediche.

<table><tbody><tr><td>Provette di reazione da 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Provette canociali da 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polipropilene a parete sottile open-top da 15 mL</td><td>Beckman Coulter Scienze della vita</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm (per ultracentrifugazione)</td></tr><tr><td>Provette canoniche da 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x buffer GC</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F519L</td><td></td></tr><tr><td>6x Colorante TriTrack DNA Caricamento&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>R1161</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Meridiano BIOSCIENZE</td><td>BIO-41025</td><td>Grado molecolare</td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti J-30I</td><td>Beckman Coulter Scienze della vita</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>Acido borico&nbsp;</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>NEB</td><td>R3733S</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio esaidrata</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>7774-34-7</td><td>97 %, extra puro&nbsp;</td></tr><tr><td>Densimetro di celle</td><td>Harvard Biochrom</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato acido di sodio</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>Grado farmaceutico</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur in vetro usa e getta</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>230 millimetri</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>10 U/&micro; L</td></tr><tr><td>Miscela dNTP (10 mM per dNTP)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>Prodotto interno.</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>Costrutto plasmidico che contiene sgRNA CRISPR-Cas12/ModA</td></tr><tr><td>DS-spCas (sistema CRISPR-Cas9)</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>48645 (numero accessorio addgene)</td><td>Plasmide per la costruzione di plasmidi CRISPR-Cas contenenti spaziatori (sistema CRISPR-Cas9) per la mutagenesi dei fagi (passaggio 3.2)</td></tr><tr><td>Ceppo B di E. coli Il ceppo è stato utilizzato per l'infezione da T4</td><td>DSMZ</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>Escherichia coli (Migula 1895) Castellani e Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)</td></tr><tr><td>Ceppo di espressione di E. coli BL21 (DE3), cellula competente</td><td>Invitrogen</td><td>C600003</td><td>Ceppo di espressione, cellule competenti.</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alfa; Ceppo di clonazione, cellule competenti</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>Ceppo di clonazione, cellule competenti.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (assoluto)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Cella a flusso Flongle</td><td>Tecnologie Oxford Nanopore</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>R10.4.1. chimica, https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>Kit di miniprep plasmidico Gene JET&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Scala del DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Scala del DNA GeneRuler ULR</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SM1213</td><td></td></tr><tr><td>Maestro del gradiente 108</td><td>BIOCOMP</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Centrifuga Heraeus Pico 17</td><td>Termo Scientifico</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Infors HT Incubatore Minitron</td><td>Infors AG</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>Isopropil-beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Carl Roth</td><td>T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Carl-Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-medium (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl-Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo MinION&nbsp;</td><td>Tecnologie Oxfrod Nanopore</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>Primer diretto per l'introduzione della mutazione puntiforme per ModA E165A e per l'introduzione di estremità appiccicose per la clonazione Golden Gate (Passaggio 3.1)</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>IDT</td><td>CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC</td><td>Primer inverso per l'introduzione di mutazioni puntiformi per ModA E165A e per l'introduzione di estremità appiccicose per la clonazione Golden Gate (Passaggio 3.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG</td><td>Primer diretto per la generazione di spaziatori per sistemi CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 per mutagenesi e controselezione dei fagi (fase 3.2 e fase 4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>Primer inverso per la generazione di spaziatori per sistemi CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 per mutagenesi e controselezione dei fagi (fase 3.2 e fase 4.1)</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop ND-1000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>Kit NucleoMag</td><td>Machery Nagel</td><td>RIFERIMENTO 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di digestione nucleosidica</td><td>Biolaboratori del New England</td><td>Codice: M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560 (sistema CRISPR-Cas13)</td><td>Addgene</td><td>186236 (numero accessorio addgene)</td><td>Sistema CRISPR-Cas13 codificante plasmidi per la controselezione (passo 4.1)</td></tr><tr><td>Plasmide pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene</td><td>122186 (numero accessorio addgene)</td><td>Plasmide per la costruzione di plasmidi CRISPR-Cas contenenti spaziatori (sistema CRISPR-Cas12) per la mutagenesi dei fagi (fase 3.2)</td></tr><tr><td>Recipienti di reazione per PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>PeqVERDE</td><td>VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Prodotto interno.</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>Il plasmide è disponibile su richiesta, la mappa plasmidica è reperibile al seguente https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Prodotto interno.</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>Plasmide per la costruzione di DNA pET28a_NgTET_donor tramite Golden Gate Cloning (fase 3.1), plasmide è disponibile su richiesta, la mappa plasmidica è reperibile al seguente https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm con camme</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&micro; L</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Monobasico</td></tr><tr><td>Alimentatore universale PowerPac</td><td>Rabbia bio</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Fluormetro Quantus, sistema QuantiFluor dsDNA</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A/T1&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>EN0551</td><td>miscela 2 mg/mL di RNasi A 5000 U/mL di RNasi T1&nbsp;</td></tr><tr><td>Roti-Aqua P/C/I per l'estrazione del DNA&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X985.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sequenziamento della legatura SQK-LSK109</td><td>Tecnologie Oxford Nanopore</td><td>nessun catalogo&nbsp; numero</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Filtri Steritop, 0,22 & micro; m Dimensione dei pori</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 mL e 500 mL</td></tr><tr><td>Streptomicina 50 mg/L</td><td>Carl Roth</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>Succrose</td><td>NeoFroxx GmbH</td><td>57-50-1</td><td>per biologia molecolare&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotore in alluminio con benna oscillante&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Scienze della vita</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi 5 U/&micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tampone DNA ligasi T4</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>B69</td><td></td></tr><tr><td>Provette a parete pesante senza bordo</td><td>Karl Hecht GmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>Termociclatore, T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua, VWB2&nbsp;</td><td>VWR</td><td>462-0557</td><td>Volume 12 L</td></tr></tbody></table>

mutagenesi precisa dei fagi con i sistemi crispr-cas assistiti da ngtet

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

Identificazione della banda fagica nel gradiente. La visibilità della banda dei fagi nel gradiente dipende dalla concentrazione di fagi nel campione iniziale caricato sul gradiente. Quando il fago è sufficientemente concentrato (~&gt;1 × 1011 PFU/mL), la banda può essere vista chiaramente illuminando il gradiente dal basso con una sorgente luminosa (vedi Figura 3).
Tuttavia, a basse concentrazioni di fagi, la banda potrebbe non esser...

Mutagenesi precisa dei fagi con i sistemi CRISPR-Cas assistiti da NgTET

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

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Bioingegneria

La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di un gene basate su CRISPR/Cas9 modifica del sistema per la riparazione delle mutazioni puntiformi in cellule di mammifero. Qui, usiamo un approccio combinatorio di gene editing con una dettagliata strategia sperimentale proseguimento per misurare indel formazione nel sito di destinazione — in sostanza, l'analisi in loco mutagenesi.

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l'efficienza di editing.

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

Qui, presentiamo un protocollo per ottimizzare CRISPR-Cas9 per ottenere una maggiore specificità senza la perdita di attività sul bersaglio. Utilizziamo un approccio diretto evoluzione chiamato Sniper-schermo per trovare un mutante Cas9 con le caratteristiche desiderate. Cecchino-Cas9 è compatibile con tronco singolo-guida RNAs e consegna in un formato della ribonucleoproteina, ben note strategie per conseguire maggiore specificità.

Utilizzando il cecchino-Cas9 a minimizzare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9 senza la perdita di attività On-target tramite Evolution diretto

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l'editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Questo studio fornisce una procedura sistematicamente ottimizzata di costruzione basata sulla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti, nonché un metodo dettagliato per la crioconservazione e la rianimazione delle uova di locuste.

Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

Un ostacolo significativo a tecnologie come CRISPR sono gli eventi fuori bersaglio che possono interrompere i geni vitali. CIRCLE-seq ("Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing") è una tecnica progettata per identificare i siti di scissione non intenzionali. Questo metodo mappa l'attività dell'intero genoma di CRISPR-Cas9 con alta sensibilità e senza bias.

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

Scopri la mutagenesi CRISPR-Cas senza cicatrici nei batteriofagi usando l'enzima NgTET. Questo metodo avanzato riduce le modifiche del DNA e migliora l'ingegneria genetica dei fagi per applicazioni in biotecnologia e terapia fagica.

Mutagenesi precisa dei fagi con i sistemi CRISPR-Cas assistiti da NgTET

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