Valutazione delle risposte delle foglie ai metaboliti secondari microbici utilizzando un formato ad alto rendimento

Il mio laboratorio si occupa delle interazioni tra i microbi vegetali con l'obiettivo finale di migliorare la resistenza delle colture di foche utilizzando la genetica. Gli sviluppi recenti hanno dimostrato che i metaboliti secondari microbici svolgono un ruolo chiave nel promuovere la suscettibilità o la resistenza delle piante. Per cominciare, usa un foro in sughero con diametro di quattro millimetri per raccogliere tre dischi fogliari per pianta, evitando la vena centrale.

Con l'estremità affilata applica un movimento di torsione per evitare la macerazione del tessuto. Aggiungere metaboliti secondari o trattamenti con solventi alla concentrazione desiderata in singoli pozzi di una piastra da 96 pozzi per raggiungere un volume finale di 200 microlitri. Posiziona delicatamente i dischi delle foglie nei pozzi.

Posizionare la piastra a 96 pozzi con il coperchio rimosso in un vaso a campana dotato di un ugello a vuoto. Poi, collega il tubo del vuoto all'ugello del campanellino e attiva la pressione del vuoto a 9,8 libbre per pollice quadrato per 10 secondi. Spegni il vuoto e rilascia lentamente la pressione per 10 secondi, poi ripeti il ciclo del vuoto.

Ora rimetti il coperchio sulla piastra a 96 pozzi e incubala su uno shaker orbitale sotto una fonte di luce. Posizionate 23 centimetri sopra lo shaker per quattro ore. Lava la sonda con acqua ultrapura e tamponala leggermente su una salvietta senza pelucchi per asciugare.

Annota la lettura della conducibilità dell'acqua per riferimento futuro. Tra le quattro e le sei ore dopo il trattamento, si misura e registra la conducibilità nei singoli pozzi immergendo la sonda nel liquido che circonda il disco fogliare. Tieni la piastra a un angolo di 45 gradi per assicurarti che la sonda sia completamente immersa.

Dopo il risciacquo della sonda è dimostrata in precedenza, si verifica occasionalmente la conducibilità dell'acqua per confermare la stabilità della sonda. Poi, applicare una pellicola di plastica sul soffitto sopra la piastra a 96 pozzi e riportarla allo shaker orbitale per l'incubazione notturna. Per preparare il substrato perossidasi, riscaldare 40 millilitri di acqua sterile distillata a 70 gradi Celsius in un becher con una barra di mescolare.

Sciogli 50 milligrammi di cinque amminosalicili in acqua riscaldata. Successivamente, aggiungi acqua aggiuntiva per portare il volume totale a 50 millilitri e regola il pH a sei usando idrossido di sodio. Proteggi la soluzione fotosensibile coprendo il contenitore con carta stagnola.

In un tubo conico ambrato da 50 millilitri, preparare una soluzione di perossido di idrogeno all'1% in acqua ultrapura. Successivamente, aggiungere 10 microlitri della soluzione di perossido di idrogeno all'1% per millilitro di soluzione di cinque amminosilici necessari per generare il mezzo di saggio. Nel momento desiderato, mescolare cinque volte e poi trasferire 50 microlitri da ciascun pozzetto della piastra campione a una nuova piastra di campionamento.

Aggiungi 50 microlitri del mezzo per il test e incuba a temperatura ambiente per tre minuti. Per fermare la reazione, aggiungere 20 microlitri di due idrossido di sodio normali a ciascun pozzo e utilizzare un lettore di lastre per misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 595 nanometri. L'acqua e il 0,1% di dimetilsolfosdo hanno prodotto livelli simili di perdita di ioni e perossidasi, convalidandone l'uso come controlli negativi.

Il trattamento con un micromolare FLG 22 ha indotto significativamente perdita di ioni, attività di perossidasi e produzione di callosi, confermandone il controllo positivo robusto. Il trattamento con gramillina ha indotto una significativa perdita di ioni e produzione di callosi, ma ha avuto effetti variabili sull'attività della perossidasi. La surfactina a 10 micromolari ha indotto sia l'attività della perossidasi sia la produzione di callosi, mentre la perdita ionica è rimasta invariata.

Il trattamento con tossina T-2 ha soppresso l'attività della perossidasi, inducendo la produzione di callose senza alcun impatto sulla perdita di ioni. Il nostro saggio idro permette ai ricercatori di campionare tre diverse risposte allo stress nello stesso campione, consentendo così di sfruttare quantità limitate di metaboliti microbici secondari. La possibilità di confrontare 96 campioni nella stessa piastra permette ai ricercatori di effettuare screening a livello di genetica delle popolazioni, o biologia dei sistemi, per comprendere le interazioni tra i microbi vegetali.

La mia ricerca continuerà a concentrarsi sulle interazioni tra i microbi vegetali e sulla caratterizzazione dei geni vegetali che possiamo sfruttare per sviluppare la resistenza alle malattie nelle colture cerealicole.