Misurazione dell'invecchiamento delle singole cellule con un biomarcatore basato sull'imaging della cromatina e dell'invecchiamento epigenetico

Abbiamo sviluppato cromatina basata sull'imaging e l'immagine epigenetica dell'età, una tecnica innovativa progettata per quantificare l'invecchiamento e il ringiovanimento a risoluzione cellulare singola. Gli orologi di metilazione del DNA stimano l'età biologica, ma dipendono dalla regressione lineare, necessitano di grandi coorti e distruggono i campioni, rendendoli costosi e inadatti a studi su larga scala o longitudinali. Per cominciare, trasferire organi e tessuti congelati in una malta pre-raffreddata posta su ghiaccio secco.

Versare azoto liquido sul tessuto congelato e macinarlo accuratamente con un pestello pre-raffreddato finché non si ottiene una polvere uniformemente fine. Utilizzando una spatola metallica pre-raffreddata, aliquota il tessuto macinato in più tubi. Dopo aver estratto i nuclei, mescolali con il blu di tripano in un rapporto uguale in un tubo separato.

Trasferisci 10 microlitri della miscela a un emocitometro, oppure caricala in un contatore cellulare automatico. Inserisci e verifica tutti i metadati, inclusi ID campioni, condizioni e biomarcatori nella mappa delle placche ed esporta un file CSV. Ora, eroga 10.000 nuclei per pozzo in un volume da 20-30 microlitri in una piastra da 384 pozzi.

Centrifuga la piastra a 1000g, con l'accelerazione impostata a nove e la decelerazione a quattro, per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, fissare i nuclei aggiungendo un volume uguale di paraformaldeide e PBS all'8%, e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il fissativo, aggiungere 30 microlitri di glicina molare da 0,1 molari in PBS e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere la soluzione di glicina e lavare i pozzi due volte con 100 microlitri di PBS. Rimuovere il PBS da ogni pozzo e aggiungere 30 microlitri di soluzione bloccante contenente 2% BSA e 0,5% Triton X-100 in PBS. Incubare il piatto per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, incubare il campione con 25 microlitri di soluzione primaria di anticorpi a quattro gradi Celsius. Successivamente, lava i pozzi tre volte con 100 microlitri di PBS, ciascuno dei quali dura tre minuti a temperatura ambiente. Aggiungi 25 microlitri di soluzione secondaria di anticorpi e incuba per due ore a quattro gradi Celsius.

Poi, lava i pozzi tre volte con 100 microlitri di PBS, ciascuno dei quali dura tre minuti a temperatura ambiente. Tingere i nuclei con DAPI o Hoechst aggiungendo 30 microlitri del colorante a una concentrazione di 0,01 milligrammi per millilitro, e lavare la piastra una volta con 100 microlitri di PBS per rimuovere il colorante in eccesso. Scarica gli script di workflow dal repository GitHub.

Una volta completato il download, scomprimi il file per estrarne il contenuto. Organizza il repository di immagini clonate in modo che la struttura delle cartelle corrisponda al formato assunto dal flusso di lavoro per la corretta esecuzione degli script. Poi, apri l'applicazione Terminal se funziona su Linux o Mac OS, oppure l'applicazione WSL se usi Windows.

Cambia la directory operativa nella cartella del repository clonato digitando il comando richiesto nel terminale e premendo Invio. Crea un nuovo ambiente computazionale chiamato Image_workflow usando Conda con Python versione 3.10 e premi Invio. Attiva l'ambiente Conda appena creato con il comando Conda attiva Image_workflow.

Installa Poetry, un gestore di pacchetti Python, all'interno dell'ambiente attivato usando l'installatore PIP. Poi, installa tutti i pacchetti Python necessari per il flusso di lavoro usando Poetry. Ora, configura CUDA all'interno dell'ambiente Conda per abilitare la funzionalità dell'unità di elaborazione grafica durante la fase di segmentazione.

Apri l'applicazione Terminal e cambia la cartella in quella clonata. Attiva l'ambiente Conda digitando il comando qui sotto e premendo Invio. Apri il file principale del flusso di lavoro in un editor di codice o testo come VS Code o Notepad per configurare i parametri di analisi.

Imposta il nome del progetto assegnando la variabile p a un breve identificatore di file system safe utilizzato per organizzare gli output. Imposta la lista dei canali per l'estrazione delle feature in CHS, incluso il canale di segmentazione se sono richieste le feature di quel canale. Utilizzando ImageIndex e l'etichetta del canale come chiave, mappa l'identificatore del canale immagine dai nomi dei file all'intestazione esatta della mappa a targa con sensibilità a targhe salvata in precedenza.

Poi, imposta le posizioni dei dati assegnando orgDataLoadPath alla route del dataset, orgDataSubfolder alla sottocartella immagine se necessario, e resultsSavePath alla rotta di output. Conferma l'estensione del nome file in imageFileFormat. Poi, modifica imageFileRegEx per usare gruppi di cattura con nomi Python per le parti richieste, inclusi riga, colonna, campo, posizione Z e canale.

Ora, imposta il canale di segmentazione in segmentation_ch al canale nucleare usato per il rilevamento degli oggetti. Decidi se usare la correzione dell'illuminazione impostando un illumiCorrection e impostandolo su true per calcolare e applicare modelli base. Poi, imposta la dimensione fisica del voxel in micrometri in voxel_dim come ZYX usando i metadati del microscopio.

Salva il file e chiudi l'editor dopo aver verificato ogni parametro. Infine, esegui lo script del workflow per ottenere letture delle immagini ed eseguire la validazione, mantenendo il terminale aperto mentre lo script è in esecuzione. Visualizza i risultati ed esporta le letture delle immagini grezze per ulteriori analisi in software esterni.

Immagini rappresentative di cellule staminali pluripotenti indotte hanno mostrato nuclei chiaramente separati colorati con DAPI, istona trimetilata H3 alla lisina 27 e istona acetilata H3 alla lisina 27. L'analisi delle immagini dei muscoli epatici e scheletrici ha rivelato una differenza significativa tra campioni giovani e vecchi, con topi OSKM anziani che mostrano immagini ridotte rispetto agli anziani, indicando una riprogrammazione parziale. L'analisi di singoli animali ha indicato che alcuni vecchi campioni OSKM mostravano valori di immagine significativamente ridotti rispetto ai topi vecchi.

Questo protocollo consente ai ricercatori di indagare i cambiamenti associati all'età nell'organizzazione della cromatina ed epigenetica a una singola risoluzione cellulare attraverso diversi tipi cellulari e tessuti differenti. Il nostro metodo basato sull'imaging è non distruttivo, preserva la struttura della cromatina, permette misurazioni ripetute ed è più conveniente in studi su larga scala o longitudinali. Le ricerche future si concentreranno sull'aggiunta di più marcatori epigenetici e sullo studio delle strutture intranucleari legate all'invecchiamento.