Name: Isolamento dellRNA dallepitelio del cristallino oculare di topo e dalle masse di massa delle cellule fibrose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Scopri un metodo per isolare l'RNA dalle cellule epiteliali e dalle masse di fibre del cristallino del topo. Questa tecnica consente l'analisi trascrittomica differenziale per studiare le patologie oculari legate all'età.

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La lente oculare è un organo trasparente che focalizza finemente la luce sulla retina per produrre un'immagine chiara. Il cristallino è composto da due tipi principali di cellule: un monostrato di cellule epiteliali che coprono l'emisfero anteriore e cellule fibrose che costituiscono la massa del tessuto (Figura 1). Il cristallino è avvolto da una membrana basale collagenica nota come capsula del cristallino, a cui aderiscono strettamente le cellule epiteliali. Man mano che il cristallino cresce, le cellule epiteliali all'equatore proliferano e si differenziano in gusci nascenti di cellule fibrose che sono stratificate sul cristallino in modo concentrico 1,2,3. La crescita del cristallino per tutta la vita dipende dalla continua proliferazione di questa piccola popolazione di cellule epiteliali equatoriali che costituiscono la zona germinativa4. Man mano che le cellule delle fibre maturano, tutti gli organelli cellulari vengono degradati per eliminare gli oggetti che diffondono la luce 5,6,7,8,9,10,11 e mantenere la trasparenza dei tessuti, e le cellule delle fibre più interne vengono infine compattate, risultando in un centro della lente rigido 9,12. A causa della capsula del cristallino circostante, non c'è ricambio cellulare nel cristallino e le fibre seminali rimangono al centro del cristallino per tutta la vita man mano che vengono aggiunte nuove fibre alla periferia del tessuto o alla corteccia. Le cellule delle fibre della lente hanno proprietà ottiche diverse a seconda della loro età e possono fornire un'istantanea temporale delle diverse caratteristiche biologiche in ogni stadio13.
Nonostante le opzioni chirurgiche disponibili, la cataratta, definita come qualsiasi opacità nel cristallino normalmente trasparente, rimane la principale causa di cecità nel mondo14. La cataratta può manifestarsi nell'epitelio del cristallino, nella corteccia o nel nucleo con diverse fisiopatologie15. Tuttavia, i meccanismi cellulari e molecolari della formazione della cataratta rimangono poco chiari16,17. Per capire meglio come prevenire questi diversi tipi di cataratta e sviluppare alternative alla chirurgia, dobbiamo capire meglio come questi diversi tipi di cellule mantengono la loro omeostasi nel cristallino.
Le cellule epiteliali e le cellule fibrose svolgono ruoli fisiologici diversi nel cristallino. La proliferazione cellulare, ad esempio, è limitata all'epitelio18 del cristallino. Nel frattempo, le fibre della lente costituiscono la massa principale della lente, fornendo struttura e proprietà di rifrazione alla lente9. Per ottenere una prospettiva più sfumata dei processi biologici coinvolti nei diversi compartimenti del cristallino, le cellule epiteliali e le cellule fibrose devono essere studiate separatamente. Qui, presentiamo un metodo per isolare l'epitelio dalla massa cellulare della fibra, estrarre l'mRNA da ciascuna frazione e analizzare questi trascritti utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69079/69079fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagramma anatomico della lente. Il cristallino è composto da due tipi di cellule, un monostrato di cellule epiteliali (blu e arancione) che copre l'emisfero anteriore e una massa di fibre del cristallino (bianco). Il tessuto è circondato da una sottile membrana collagenica, nota come capsula del cristallino (abbronzatura). Le cellule epiteliali anteriori (blu) sono quiescenti mentre le cellule epiteliali equatoriali (arancione) proliferano, si differenziano e si allungano per diventare nuovi strati di cellule fibrose (bianco) alla periferia del cristallino. Le nuove generazioni di celle in fibra vengono sovrapposte alle generazioni precedenti di fibre in gusci concentrici. Le cellule più vecchie delle fibre del cristallino sono compattate al centro del tessuto. Questa cifra è stata modificata da Cheng (2024)38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69079/69079fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Centrifuga e rotore</td><td>Fisher Scientifico</td><td>14285554PM</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio, grado HPLC</td><td>Alfa Aesar</td><td>22920</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (a prova di 190)</td><td>Laboratori Decon</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (a prova di 200)</td><td>Fisher BioReagenti</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pestello a pellet</td><td>Fisher Scientifico</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>pinze, curve; Pinzette per studenti #7</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>pinze, diritte; Dumont #5</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>pinze, diritte; Pinzette per studenti #4</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>501978</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, piccoli</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Pulizia delicata per attività</td></tr><tr><td>Applicatore di film adesivo MicroAmp</td><td>Biosistemi Applicati</td><td>4333183</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti con codice a barre</td><td>Biosistemi Applicati</td><td>4483485</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettatori</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 01-671-120</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio, Dissezione</td><td>Carl Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Copertura Adesiva Ottica</td><td>Biosistemi Applicati</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Termociclatore</td><td>Biosistemi Applicati</td><td>Codice: A37834</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice a piastre MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado molecolare</td><td>Fisher Scientifico</td><td>BP28191</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis a microvolume Nanodrop One</td><td>Termo Scientifico</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>MiniVassoi Nunc MicroWell</td><td>Fisher Scientifico</td><td>12-565-154</td><td>Vassoio di dissezione</td></tr><tr><td>Provette per PCR</td><td>VWR</td><td>201007-012</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientifico</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, 1x Dulbecco's</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 10 &; L Graduato</td><td>Stati Uniti d'America Scientific</td><td>1161-3700</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 1250 &; L XL Graduato</td><td>Stati Uniti d'America Scientific</td><td>1161-1720</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 200 &; micro; Profilo a L Graduato</td><td>Stati Uniti d'America Scientific</td><td>1163-1700</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale QuantStudio 3</td><td>Biosistemi Applicati</td><td>Codice A28567</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa, SuperScript IV VILO&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>Trascrittasi inversa altamente processiva e termostabile</td></tr><tr><td>Kit RNA Clean e Concentratore 5</td><td>Zymo</td><td>ZR1013</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di RNasi</td><td>Fisher BioReagenti</td><td>BP2819</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>Anno 2020</td><td>Soluzione di decontaminazione con RNasi</td></tr><tr><td>SealRite Microcentrifuga Provette da 1,5 mL</td><td>Stati Uniti d'America Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas SuperFine 8 cm</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>501778</td><td>Forbici</td></tr><tr><td>TaqMan FAST Advanced Master Mix per qPCR</td><td>Biosistemi Applicati</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Sonda per il saggio di espressione genica (FAM) TaqMan (MTO)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>4448892</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Soluzione acido-guanidinio-fenolo</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Termo Scientifico</td><td>88880017</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dell'rna dall'epitelio del cristallino oculare di topo e dalle masse di massa delle cellule fibrose

RNA Isolation from Mouse Ocular Lens Epithelium and Fiber Cell Bulk Masses

L'epitelio del cristallino e le fibre sono stati isolati da topi selvatici di 6-7 settimane. Per questi esperimenti sono stati utilizzati tre topi e 2 capsule di lenti o 2 masse cellulari di fibre di ciascun topo sono state raggruppate insieme per una replica biologica. Come descritto nel protocollo, l'RNA è stato estratto utilizzando la separazione di fase del reagente TRIzol. In media, una coppia di epitelio a cristallino e masse di massa di fibre ha prodotto rispettivamente 0,8 μg (SD ± 0,2) e 9,7 μg (SD ± 2,3) di RNA...

Isolamento dell'RNA dall'epitelio del cristallino oculare di topo e dalle masse di massa delle cellule fibrose

The lens is a specialized, transparent tissue in the anterior chamber of the eye that is comprised of two major cell types, epithelial cells and fiber ...

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Biologia

Qui, descriviamo un protocollo per una microdissezione laser riproducibile (LCM) per isolare il trabecolato (TM) per analisi di RNA a valle. La capacità di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica nella TM vi aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari delle malattie oculari correlate a TM.

Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica

La ghiandola lacrimale (LG) ha due tipi di cellule che esprimono α-liscio muscolo actina (αSMA): cellule miepiteliali (MECs) e pericytes. I MECs sono di origine ectodermica, trovati in molti tessuti ghiandolari, mentre i periciti sono cellule muscolari lisce vascolari di origine endodermica. Questo protocollo isola i MECs e i periciti di murine LGs.

Isolamento delle cellule Miepiteliali da adulti murina lacrimale e ghiandole sottomandibolari

Questo protocollo descrive i metodi per preparare le cellule delle fibre periferiche, mature e nucleari del cristallino per la colorazione in immunofluorescenza per studiare le complesse interdigitazioni cellula-cellula e l'architettura della membrana.

Preparazione e colorazione in immunofluorescenza di fasci e cellule a fibra singola dalla corteccia e dal nucleo del cristallino dell'occhio

Questo manoscritto delinea un protocollo video dettagliato per la coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino (LEC), con l'obiettivo di migliorare la riproducibilità e aiutare la ricerca sulla cataratta e sull'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Offre istruzioni dettagliate sulla dissezione delle lenti, l'isolamento e la convalida dei LEC, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i nuovi arrivati nel settore.

Ottimizzazione della coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino di topo: una guida completa alla tripsinizzazione

I presenti protocolli descrivono nuove immagini a montaggio intero per la visualizzazione di strutture periferiche nel cristallino oculare con metodi per la quantificazione dell'immagine. Questi protocolli possono essere utilizzati negli studi per comprendere meglio la relazione tra le strutture su microscala delle lenti e lo sviluppo/funzione delle lenti.

Imaging a montaggio completo per visualizzare e quantificare la struttura periferica del cristallino, la morfologia e l'organizzazione cellulare

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Recentemente abbiamo identificato l'irrigidimento capillare retinico come un nuovo paradigma per la disfunzione retinica associata al diabete. Questo protocollo elabora le fasi per l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale da colture endoteliali retiniche, seguite da una descrizione della tecnica di misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica.

Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Qui presentiamo un protocollo per ottenere sospensioni monocellulari di alta qualità da intere cornee di topo attraverso la digestione sequenziale con collagenasi A e tripsina. Questo metodo produce cellule singole vitali con alta integrità dell'RNA, rendendole compatibili con applicazioni a valle come il sequenziamento a RNA a singola cellula e il citometroa flusso y.

Un protocollo per il prelievo della sospensione a singola cellula dalle cornee dei topi

Scopri un metodo per isolare l'RNA dalle cellule epiteliali e dalle masse di fibre del cristallino del topo. Questa tecnica consente l'analisi trascrittomica differenziale per studiare le patologie oculari legate all'età.

Isolamento dell'RNA dall'epitelio del cristallino oculare di topo e dalle masse di massa delle cellule fibrose

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