Generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido
17 ottobre 2025
Questo protocollo delinea un metodo per la produzione di organoidi cutanei contenenti follicoli piliferi da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura planare e fisiologicamente rilevante di interfaccia aria-liquido per replicare l'architettura e la funzione della pelle.
L'obiettivo della mia ricerca è cercare di sviluppare un modello di danno indotto da UVB così da poter studiare la patogenicità di una malattia rara, la xeroderma pigmentosa, o più precisamente, XPA. Una delle sfide di questi modelli in vitro è che ci vuole molto tempo per essere coltivati, circa quattro mesi, e dato che è ancora un campo piuttosto giovane, dobbiamo ancora caratterizzarli un po' meglio. I vantaggi di questo modello, così come il modello 3D derivato dall'hiPSC, la cultura che l'interfaccia aria-liquido riproduce l'architettura della pelle umana e presenta un'appendice cutanea come la ghiandola sebacea e i follicoli piliferi.
Per cominciare, prepara una soluzione a un molare aggiungendo pellet di idrossido di sodio a un tubo vuoto da 15 millilitri. Aggiungi acqua distillata ai pellet e fai un vortice nel tubo per sciogliere i pellet. Sterilizza la soluzione di idrossido di sodio da 0,1 molari utilizzando un filtro a membrana di 0,2 micrometri di dimensione poro.
Sul ghiaccio, diluire la soluzione di collagene di tipo I con 10 tempi PBS, cinque millimolari idrossido di sodio e acqua distillata per regolare il volume finale. Distribuire 150 microlitri di questa soluzione di collagene in ogni inserto, posizionati in una piastra standard a 12 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti per permettere al gel di collagene di polimerizzarsi.
Poi, taglia le punte P1000 con un bisturi riscaldato per creare punte a canna larga. Poi, si usano le ampie punte dell'orifizio per posizionare una struttura cistica selezionata con una piccola quantità di mezzo sul coperchio di una piastra di Petri da 10 centimetri. Rimuovere con cura eventuali sottoprodotti della struttura usando un bisturi sterile, mentre la stabilizzi con una pinza sterile sul lato opposto.
Esporre circa un millimetro da entrambe le estremità di un organoide cutaneo cistico adiacente alla prima incisione utilizzando un bisturi. Usando pinze sterili, spiega delicatamente lo strato superiore della pelle. Taglia il tessuto in due o quattro pezzi, a seconda della dimensione.
Poi, usando una pinza sterile, sposta ogni pezzo su un inserto rivestito di collagene con l'epidermide rivolta verso l'alto. Aggiungi 600 microlitri di OMM a ciascun pozzo di una piastra standard a 12 pozzi. Trasferire l'inserto di nuovo sulla piastra a 12 pozzi contenente OMM.
Poi si inserisce la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Un singolo aggregato cellulare denso che contiene la maggior parte delle cellule si è formato entro il giorno zero tramite una gestione e centrifugazione attente. Una corretta induzione dell'epidermia superficiale ha portato alla formazione di un epitelio sottile e trasparente sullo strato esterno dell'aggregato entro il terzo giorno. Al dodicesimo giorno, uno strato sottile di cellule mesenchimali si era accumulato su un polo della cisti.
Placode e pioli per capelli sono diventati visibili tra i giorni 50 e 80, a seguito della coinduzione epiteliale e mesenchimatore. Gli organoidi privi di placodi visibili mostravano un epitelio estremamente sottile e venivano esclusi dalla transizione planare. Solo cisti di almeno cinque millimetri di diametro con sottoprodotti polarizzati sono state selezionate per la generazione di organoidi cutanei planari.
I follicoli piliferi si sono allungati progressivamente durante i 27 giorni di coltura dell'interfaccia aria-liquido. Le ghiandole sebacee sono diventate visibili intorno al giorno 14 nella configurazione planare. La pigmentazione negli organoidi aumentava gradualmente nel tempo.
La colorazione di ematossilina ed eosina ha rivelato un epitelio stratificato e una membrana basale che lo separa dal derma. La colorazione immunofluorescenza ha confermato un'architettura simile alla pelle umana negli organoidi cutanei planari.
Panoramica
Questo studio sviluppa un modello di danno indotto da UVB per indagare il xeroderma pigmentoso, concentrandosi sulla generazione di organoidi cutanei che includono follicoli piliferi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Gli organoidi vengono coltivati utilizzando un'interfaccia aria-liquido fisiologicamente rilevante per mimare in modo efficace l'architettura e la funzione della pelle umana.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Patogenicità della xeroderma pigmentosum
- Sviluppo di modelli cutanei in vitro
- Utilizzo della tecnologia degli organoidi tridimensionali
Sfondo
- Sfide nella coltura di organoidi cutanei
- Conoscenze attuali sulla biologia della pelle
- Importanza dei follicoli piliferi e delle appendici cutanee nella ricerca
Metodi Utilizzati
- Cultura all'interfaccia aria-liquido per lo sviluppo di organoidi
- Cellule staminali pluripotenti indotte umane come fonte
- Tecniche di immunofluorescenza e di colorazione istologica
Risultati principali
- Generazione con successo di organoidi cutanei con follicoli piliferi
- Osservazione dell'induzione congiunta epidermica e mesenchimale
- Convalida dell'architettura simile alla pelle umana mediante colorazione istologica
Conclusioni
- Questo studio fornisce informazioni sullo sviluppo di organoidi cutanei da cellule staminali.
- Illustra il potenziale di utilizzo di questo modello per comprendere le malattie della pelle.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Gli organoidi cutanei planari dotati di peli derivati da iPSC umane, coltivati all'interfaccia aria-liquido, forniscono un sistema in vitro fisiologicamente rilevante per lo studio della biologia della pelle e della formazione degli annessi cutanei. Questa piattaforma consente una modellizzazione predittiva delle risposte tessutali a stress ambientali e agenti farmacologici, sostenendo la ricerca traslazionale e la riduzione dei rischi meccanicistici nello sviluppo preclinico dermatologico. L'approccio aumenta la fiducia nel portafoglio progettuale permettendo modelli cutanei robusti e riproducibili per la fase iniziale della scoperta e della valutazione preclinica.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biotecnologica e farmaceutica
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi delle interazioni intercellulari all'interno di un microambiente cutaneo umano.
- Consente una riduzione meccanicistica dei rischi modellando lo sviluppo degli annessi cutanei e la stratificazione del tessuto.
- Facilita la validazione funzionale di bersagli per i percorsi associati alla pelle e i meccanismi di malattie rare.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per la valutazione quantitativa delle risposte ai farmaci e dei danni ai tessuti.
- Offre sistemi biologici validati con follicoli piliferi e ghiandole sebacee per la valutazione di composti.
- Consente la scalabilità dei saggi e il riutilizzo della piattaforma per diverse applicazioni di ricerca cutanea.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Modella le risposte dei tessuti pertinenti alle malattie, inclusi i danni indotti da UVB e l'infezione da patogeni.
- Si allinea alle strategie traslazionali di biomarcatori attraverso analisi molecolari e istologiche.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, collegando la fase di scoperta con la validazione preclinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo sistema di organoidi si integra dalla fase iniziale della scoperta fino alla ricerca preclinica, consentendo la verifica di ipotesi, la chiarificazione dei percorsi molecolari e l'analisi predittiva della biologia della pelle.
- Biologia della scoperta: Supporta studi basati su ipotesi sull'architettura della pelle e sulla formazione degli annessi cutanei.
- Screening: Fornisce output riproducibili e quantitativi per saggi di risposta a farmaci e danni.
- Analisi: Consente letture molecolari e istologiche per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dalla modellizzazione in vitro agli studi preclinici sulle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per molteplici iniziative di ricerca e screening cutaneo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca cutanea.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, scalabili e riproducibili per la generazione di organoidi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento/cessazione e l'efficienza del capitale consentendo modelli robusti in vitro.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo di asset dermatologici con adeguamento al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella coltura di cellule staminali, nella manipolazione di organoidi e nell'ingegneria tissutale.
- Richiede l'accesso a strumentazioni specializzate per la coltura all'interfaccia aria-liquido e per l'analisi molecolare.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i punti di controllo di valutazione qualitativa e i criteri di selezione.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi modelli di malattia o tipi di tessuto in base all'obiettivo della ricerca.
- I lunghi tempi di coltura e la caratterizzazione in corso del campo rappresentano limitazioni pratiche da considerare.
