Name: Generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Scopri la generazione di organoidi cutanei con follicoli piliferi da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura interfaccia aria-liquido. Questo metodo permette di studiare la patogenicità del xeroderma pigmentosum.

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<ol><li>Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Nurses+Assoc%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the skin.</a> J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 avanzato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#12634010</td><td>nel testo è chiamato Advanced medium.</td></tr><tr><td>ALK5, inibitore. TGFb tipo 1, SB431542</td><td>Tocris Bioscienza</td><td>#1614</td><td>Aliquot, conserva a -20 &deg; C e &nbsp; mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 7 giorni &nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di ratto Anti-CD104 439-9B</td><td>BD in Biologia</td><td>#555719</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anticollagene tipo IV</td><td>MerckMillipore</td><td>#Ab769</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-citocheratina 10 del coniglio</td><td>Biolegend</td><td>#905401</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-loricrin del coniglio</td><td>Biolegend</td><td>#905101</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-PMEL nel topo</td><td>Novus Biologicals</td><td>#NBP2-29407&nbsp;</td><td>NA</td></tr><tr><td>Integratore di B-27, meno vitamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#12587010</td><td>Aliquot, conserva a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Inserti di coltura cellulare</td><td>Greiner Bio-one</td><td>#665641</td><td>12-pozzo, poro 0,4 & micro; m; trasparente (48 inserti/scatola); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html</td></tr><tr><td>Collagene di tipo I</td><td>Corning</td><td>#354249</td><td>Tieni la soluzione di serie a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Bisturi usa e getta sterile 0507 n. 21</td><td>Swann Morton</td><td>#0507</td><td>NA</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#14190094</td><td>NA</td></tr><tr><td>Essenziale 6 (E6) media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A1516401</td><td>chiamato hiPSC medium minimale (hiMinM)&nbsp; nel testo.</td></tr><tr><td>Fasudil</td><td>LC Labs</td><td>#F-4660</td><td>Una soluzione 1000x stock e conserva a -20 °C. Una volta scongelato, tieni a 4 gradi e gradi; C per un massimo di 14 giorni&nbsp;</td></tr><tr><td>Dissociazione delle cellule delicate&nbsp; Reagente</td><td>Tecnologie Stemcell</td><td>#100-0485</td><td>NA</td></tr><tr><td>Integratore GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#35050038</td><td>NA</td></tr><tr><td>Grado base di prenium FGF-2 umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>#130-093-842</td><td>Aliquot, conserva a -80 & deg; C e &nbsp; mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 7 giorni &nbsp;</td></tr><tr><td>LDN 193189 diidrocloruro</td><td>Tocris</td><td>#6053</td><td>Eccolò, fotosensibile, conserva a -20 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale ridotta con fattore di crescita Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td>Aliquot, conserva a -20 &deg; C e &nbsp; mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 7 giorni &nbsp;</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21985023</td><td>Sostanze pericolose, tossici, corrosive, irritanti, pericoli per la salute e per l'ambiente.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>#567530-250MG</td><td>Sostanze pericolose, corrosive e irritanti. Prepara una soluzione spontaneamente.</td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21103049</td><td>chiamato mezzo basale neurale e nbsp; nel testo.</td></tr><tr><td>Normocin 50 mg/ml</td><td>Invivogen</td><td>#ant-NR-1</td><td>nel test è stato indicato come integratore antibiotico-antimicotico. Aliquot, conserva a -20 &deg; C e &nbsp; mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 14 giorni&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropiastra Nunclon Sphera 96-WellU-Bottom</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#174929</td><td>NA</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 174930 multidish a 24 pozzi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#174930</td><td>NA</td></tr><tr><td>Supplemento N2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#17502048</td><td>Aliquot, conserva a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Oscillatore orbitale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#88881102</td><td>NA</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15070063</td><td>NA</td></tr><tr><td>Proteina BMP4 umana ricombinante</td><td>R& Sistemi D</td><td>#314-BP-010</td><td>Aliquot, conserva a -80 & deg; C e &nbsp; mantenere a 4 gradi; C per un massimo di 7 giorni &nbsp;</td></tr><tr><td>StemFlex (SF) medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A3349401</td><td>chiamato mezzo di manutenzione hiPSC (hiMM) e nbsp; nel testo.</td></tr><tr><td>SteriMax smart&nbsp;- Sterilizzatore ad anello a infrarossi</td><td>WLD-TEC</td><td>#4.002.000&nbsp;</td><td>Opzionale</td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Merck</td><td>#T4537-1EA</td><td>Stile 5; Acciaio inossidabile antimagnetico affilato come ago</td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Tecnologie Stemcell</td><td>#07180</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Planar Hair-bearing Skin Organoids Using an Air-Liquid Interface Culture System

L'ottimizzazione e i punti di controllo per la generazione di SO cistici sono stati ampiamente descritti14. Il metodo qui presentato, quindi, si concentra sui punti di controllo chiave da valutare durante lo sviluppo di organoidi cistici (Figura 2A), sulla selezione di quelli adatti alla transizione in SO planari (Figura 2B) e sui criteri utilizzati per valutare la qualità degli SO planari risultanti (Figura 1B-D e Figura 4).
Il primo passo chiave nello sviluppo degli SO cistici è la formazione di un singolo aggregato cellulare denso che incorpora la maggior parte delle cellule presenti nel pozzetto al giorno 0 (Figura 2A). Ciò si ottiene attraverso un'attenta e rapida manipolazione delle hiPSC, combinata con un'efficiente centrifugazione, che si traduce in una distribuzione omogenea delle cellule al centro del pozzetto (Figura 2A, Giorno -2). La corretta induzione dell'ectoderma di superficie porta alla formazione di un epitelio sottile e chiaro sullo strato più esterno dell'aggregato entro il giorno 3 (Figura 2A), che successivamente si sviluppa, in seguito all'induzione delle cellule mesenchimali, in aggregati cistici trasparenti contenenti un nucleo scuro di cellule mesenchimali entro il giorno 8. Tra il 12° e il 20° giorno, la cisti epiteliale viene ricoperta da un sottile strato di cellule mesenchimali che si accumulano in un polo della cisti (Figura 2A, Giorno 12). La co-induzione riuscita di cellule epiteliali e mesenchimali si traduce infine in un epitelio stratificato, consentendo la formazione di placodi e pioli di capelli, che diventano visibili tra i giorni 50 e 80 (Figura 2A, B). Selezionando gli SO appropriati sulla base di questi punti di controllo dello sviluppo, la variabilità morfologica e dimensionale può essere minimizzata al momento della transizione agli SO planari.
La presenza di placodi o pioli di capelli è il criterio di inclusione primario per la selezione di SO cistici per un ulteriore sviluppo in SO planari. L'assenza di placodi visibili di solito deriva da un difetto nella stratificazione epidermica, che appare quindi estremamente sottile (Figura 2B, Giorno 50, pannello centrale). Per l'appiattimento, vengono utilizzate solo cisti di grandi dimensioni (almeno 5 mm di diametro) con sottoprodotti concentrati in un polo e sottoprodotti minimi complessivi, mentre sono escluse quelle con sottoprodotti non polarizzati (Figura 2B).
Una volta nella loro configurazione planare, il controllo primario di qualità degli SO si basa sul monitoraggio macroscopico della crescita degli HF sotto uno stereomicroscopio. Gli scompensi spontanei si allungano progressivamente durante i 27 giorni di coltura di ALI, con ghiandole sebacee che diventano visibili intorno al giorno 14 e la pigmentazione che aumenta gradualmente nel tempo (Figura 1B, C). A causa dei vincoli spaziali imposti dalla membrana dell'inserto che si trova appena sotto il sottile gel di collagene, solo gli HF situati alla periferia del SO planare possono crescere completamente, e lo fanno con un orientamento parallelo all'inserto (Figura 1C). In particolare, il fusto del capello raramente sporge oltre la superficie della pelle. Per valutare ulteriormente la qualità degli SO planari sviluppati, possono essere incorporati in paraffina o OCT, sezionati e colorati per esaminarne la composizione e la morfologia. La colorazione H&amp;E rivela che la loro struttura assomiglia molto a quella della pelle umana (Figura 4A), con un epitelio completamente stratificato e un derma separati da una membrana basale. La colorazione in immunofluorescenza con marcatori specifici per i diversi strati epidermici, le ghiandole sebacee e i melanociti conferma ulteriormente l'architettura tissutale simile alla pelle umana degli SO planari (Figura 1D e Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig1.jpg"> 
Figura 1: Flusso di lavoro per la generazione di SO planari contenenti HF da hiPSC utilizzando un sistema di coltura ALI. Vengono mostrate la rappresentazione schematica e le immagini rappresentative dei passaggi chiave. (A) Generazione di SO cistici, essenzialmente come precedentemente descritto10, fino a quando non si formano placodi/pioli di capelli visibili intorno al giorno 80. (B) Gli SO cistici sono incisi e appiattiti, con il lato dell'epidermide rivolto verso l'alto, su un inserto di coltura cellulare rivestito di collagene di tipo I. Le colture ALI vengono mantenute per 21 giorni in condizioni umidificate, seguite da 6 giorni in condizioni asciutte. (C) Vista ad alto ingrandimento di una regione mostrata in (B), che illustra la crescita del follicolo pilifero, lo sviluppo della struttura simile a una ghiandola sebacea (punte di freccia) e la pigmentazione progressiva nel tempo. (D) Immagini confocali di sezioni planari di SO al giorno 27 dopo l'appiattimento, marcate con anticorpi anti-collagene di tipo IV insieme a rosso Nilo, che contrassegna strutture simili a ghiandole sebacee, o anticorpi anti-PMEL, che colorano i melanociti. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Barre graduate: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Abbreviazioni: SO = organoidi della pelle; HF = follicoli piliferi; hiPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte umane; ALI = interfaccia aria-liquido; Col IV = collagene di tipo IV; PMEL = proteina premelanasoma; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig2.jpg"> 
Figura 2: Immagini rappresentative della morfologia dell'aggregato cellulare nelle fasi chiave durante la produzione di SO. (A) Immagini rappresentative di SO cistiche con morfologie appropriate (pannelli di sinistra) e inadeguate (pannelli di centro e di destra) a diversi stadi. Al giorno -2, gli aggregati cellulari dovrebbero mostrare una distribuzione uniforme (pannello di sinistra), mentre una manipolazione impropria della piastra dopo la centrifugazione può interrompere la distribuzione delle cellule (pannello di destra). Al giorno 0, gli aggregati ben formati appaiono come cluster cellulari compatti e densi (pannello di sinistra), mentre la bassa vitalità cellulare provoca una morte cellulare diffusa e la perdita delle strutture 3D compatte (pannello di destra). Al giorno 3, uno strato epiteliale esterno distinto diventa visibile (pannello di sinistra), la sua assenza può indicare che la concentrazione di BMP4 necessita di ottimizzazione (pannello di destra). Al giorno 12, le cellule mesenchimali si accumulano in un polo e migrano per avvolgere la cisti epiteliale (pannello sinistro), mentre un'eccessiva differenziazione epiteliale (pannello centrale) o mesenchimale (pannello destro) impedisce una corretta stratificazione epiteliale. Al 50° giorno, gli SO presentano una morfologia bipolare, con cute cistica da un lato e sottoprodotti, prevalentemente cartilaginei, dall'altro (pannello sinistro). Un'eccessiva differenziazione epiteliale (pannello centrale) o mesenchimale (pannello destro) ostacola il corretto sviluppo della pelle. (B) Immagini rappresentative di SO cistiche con forcine per capelli visibili intorno al giorno 80. Si noti la proporzione variabile di sottoprodotti (a sinistra della curva tratteggiata) rispetto alla pelle. I tre pannelli più a sinistra consentono la generazione di 2-4 SO planari, mentre il pannello più a destra mostra un SO di qualità insufficiente per l'appiattimento. Barre di scala: 500 μm per il giorno -2, il giorno 50 e il giorno 80; 200 μm per il giorno 0, il giorno 3 e il giorno 12. Abbreviazione: SO = organoide della pelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig3.jpg"> 
Figura 3: Rappresentazione schematica dei passaggi tecnici per la produzione di SO planari. Eseguire l'appiattimento degli SO cistici sotto uno stereomicroscopio all'interno di una cappa LAF. (A) Asportare il polo che accumula i sottoprodotti dell'SO cistico utilizzando un bisturi sterile. (B) Tagliare gli arti superiori e inferiori dell'SO per facilitare l'apertura dei tessuti. (C) Tagliare il tessuto planare in 2-4 pezzi. Trasferisci e appiattisci ogni pezzo, con il lato epidermico rivolto verso l'alto, su un inserto rivestito di collagene utilizzando una pinza sterile. (D) Posizionare l'inserto di coltura contenente il tessuto appiattito in una piastra standard a 12 pozzetti contenente 600 μl di terreno. (E) Incubare la piastra a 37 °C con CO2 al 5%. (F) Vista schematica trasversale dell'organoide cutaneo raffigurato in (B). (G) Vista schematica trasversale dell'organoide cutaneo raffigurato in (C). (H) Immagine di un SO planare posizionato su un gel di collagene di tipo I versato su un inserto di coltura cellulare posizionato in una piastra a 12 pozzetti contenente 600 μL di terreno. Abbreviazioni: SO = organoide della pelle; LAF = flusso d'aria laminare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig4.jpg"> 
Figura 4: Caratterizzazione di SO planari derivati da hiPSC. (A) Immagini rappresentative in campo chiaro di SO planare colorato con H ed E ai giorni 1 e 27 dopo l'appiattimento. Entro il 27° giorno, gli SO planari mostrano una maturazione cutanea con un'epidermide pluristratificata e HF contenenti strutture simili a ghiandole sebacee (punte di freccia). (B) Le immagini confocali delle sezioni planari di SO colorate con integrina anti-β4 e anticorpi anti-cheratina 10 o anti-loricrina mostrano una differenziazione soprabasale precoce (cellule KRT10+ ) al giorno 1 e una differenziazione tardiva (strato LOR+ ) al giorno 27. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Barre di scala: 50 μm (A); 100 μm (B). Abbreviazioni: SO = organoide della pelle; hiPSC = cellula staminale pluripotente indotta umana; H&amp;E = ematossilina ed eosina; β4 = integrina b4; KRT10 = cheratina 10; LOR = loricrina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived skin organoids (SOs) containing hair follicles provide a sophisticated in vitro model for ...

generation-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-planar-hair

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Questo video descrive il protocollo dettagliato per la generazione di ricostruzioni cutanee organotipiche in vitro 3D per studiare la progressione del melanoma. Questo modello di pelle imita sia l'architettura che la complessità multicellulare degli organi in vivo.

Generazione di ricostruzioni organotipiche della pelle completa: una procedura per stabilire un modello di pelle 3D utilizzando campioni di pelle umana

Questo video mostra un test per generare organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Le iPSC umane sono indotte a formare corpi embrioidi (EB). Gli EB vengono coltivati su un'impalcatura polimerica utilizzando un mezzo di induzione, promuovendo la differenziazione in cellule staminali neurali, cellule progenitrici e neuroni immaturi. Infine, gli EB vengono incorporati in una matrice e trasferiti in un mezzo di mantenimento per la formazione di organoidi cerebrali.

Generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo manoscritto fornisce una procedura passo-passo per la derivazione e il mantenimento di cheratinociti umani da capelli strappati e la successiva generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di integrazione da vettori episomiali.

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo protocollo consente la differenziazione delle cellule pluripotenti umane in organoidi intestinali. Il protocollo imita il normale sviluppo umano differenziando le cellule in una popolazione di endoderma definitivo, endoderma dell'intestino posteriore e quindi epitelio intestinale. Ciò rende il protocollo adatto sia per lo studio dello sviluppo intestinale che per le applicazioni di modellizzazione delle malattie.

Generazione di organoidi intestinali derivati da hiPSC per applicazioni di modellizzazione dello sviluppo e delle malattie

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Per ottenere organoidi cerebrali in grandi quantità e di alta qualità, utilizziamo mini bioreattori fatti in casa.

Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

Il presente protocollo descrive le cellule staminali pluripotenti derivate dall'uomo di tipo 2 alveolari epiteliali (iAT2s). Queste cellule possono essere coltivate come sfere auto-rinnovanti in coltura 3D o adattate alla coltura di interfaccia aria-liquido (ALI).

Generazione di sfere 3D e colture di interfaccia aria-liquido 2D di cellule epiteliali alveolari di tipo 2 derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

I recenti progressi nei protocolli di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo consentono la derivazione graduale di tipi di cellule specifiche per organo. Qui, forniamo passaggi dettagliati per il mantenimento e l'espansione delle cellule basali delle vie aeree derivate da iPSC e la loro differenziazione in un epitelio mucociliare in colture di interfaccia aria-liquido.

Generazione di colture di interfaccia aria-liquido di cellule epiteliali delle vie aeree da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo descrive la generazione di vasi sanguigni auto-organizzanti da cellule staminali pluripotenti e pluripotenti indotte umane. Queste reti di vasi sanguigni mostrano una rete endoteliale estesa e connessa circondata da periciti, actina muscolare liscia e una membrana basale continua.

Generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo presenta un metodo per generare organoidi vascolari utilizzando cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Scopri la generazione di organoidi cutanei con follicoli piliferi da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura interfaccia aria-liquido. Questo metodo permette di studiare la patogenicità del xeroderma pigmentosum.

Generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido (Video) | JoVE Journal

Generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido

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