In vitro Differenziazione delle cellule T CD8 della memoria residente utilizzando il sistema di co-coltura organoide-cellula T epiteliale
3 febbraio 2026
Per studiare la differenziazione e la funzione in vitro delle cellule T CD8, le cellule T CD8 possono essere isolate dal topo per essere co-colte a lungo termine con organoidi epiteliali vaginali murini infetti preformati. Qui descriviamo questo processo e valutiamo l'acquisizione dei marcatori residenti delle cellule T della memoria durante la co-coltura.
La nostra ricerca indaga le cellule T della memoria residenti nel CD8 nel tratto riproduttivo femminile, esaminando come infezioni e malattie influenzino la loro residenza, funzione, mantenimento e potenziale terapeutico. I metodi esistenti limitano la sopravvivenza e la stabilità fenotipica delle cellule T della memoria residenti. Questo protocollo consente uno studio in vitro scalabile inducendo la residenza tissutale tramite colture organoidi di culto delle cellule T.
Per cominciare, placcare organoidi epiteliali vaginali o VEO a una densità di 10.000 cellule in 20 microlitri di estratto di membrana basale per pozzetto di una piastra a 24 pozzi. Mettere il piatto nell'incubatore e conservare le colture per sette-dieci giorni a 37 gradi Celsius. Un giorno prima della co-coltura, aspirare il materiale di coltura cellulare dai pozzi designati e lavare i pozzi con DPBS.
Aspirare il DPBS, poi erogare 600 microlitri di EDTA di tripsina preriscaldata allo 0,25% nel pozzo. Utilizzando una pipetta P1000 rivestita a BSA, si sosprive completamente per interrompere meccanicamente l'estrazione della membrana del basamento e trasferire il contenuto del pozzo in un tubo conico sterile da 15 millilitri rivestito con BSA. Ora metti il tubo conico in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Dopo cinque minuti, aggiungi 10 millilitri di 10% FBS in RPMI per placare la tripsinizzazione. Poi metti il tubo nella centrifuga e fai girare a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scarta il soprantantante. Utilizzando una punta di pipetta rivestita in BSA, risospendi il pellet in 100-300 microlitri di mezzo di coltura organoide a cellule T o DMEMF 12 semplice.
Contare le cellule usando un emocitometro. Calcola il volume di virus necessario per ottenere una molteplicità di infezione pari a 0,1 utilizzando il numero totale di cellule e il titolo virale noto. Aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi VEO selezionati per l'infezione.
Lavare ogni pozzo con 500 microlitri di DPBS preriscaldato e mettere la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo cinque minuti, scartare il DPBS. Aggiungere 500 microlitri di mezzo organoide contenente particelle virali sufficienti per ottenere una molteplicità di infezione pari a 0,1.
Posiziona il piatto in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un'ora, facendo ruotare delicatamente il piatto a mano ogni 20-30 minuti. Trasferire la quantità adeguata di estratto della membrana basale necessaria per la placcatura da meno 80 gradi Celsius a quattro gradi Celsius e lasciarlo scongelare per otto ore. Controlla i VEO al microscopio lucico per valutare dimensioni e salute generale.
Confermare che i VO hanno un diametro di circa 100 micrometri, una morfologia uniforme e una presenza minima di singole cellule. Aspirare i mezzi di coltura cellulare dai pozzi VEO e lavare ogni pozzo con 500 microlitri di DPBS sterile freddo mantenuti a due o otto gradi Celsius. Dopo aver rimosso il DPBS, aggiungere da 200 a 500 microlitri di soluzione fredda per il prelievo organoide in ciascun pozzo, assicurando almeno un volume 10 volte rispetto alla goccia estratta dalla membrana basale.
Poi, utilizzando una pipetta P200 rivestita in BSA, si interrompe meccanicamente l'estratto della membrana del basamento. Ora posiziona la piastra su uno shaker orbitale impostato a circa 100 giri al minuto a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, si utilizza una punta di pipetta rivestita a BSA per mescolare e trasferire il contenuto di ciascun pozzo in un tubo conico sterile rivestito con BSA da 15 millilitri.
Metti il tubo nella centrifuga e fai girare a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Poi scarta il soprantantante. Lavare il pellet VEO con cinque-dieci millilitri di DPBS freddo e centrifugarlo nuovamente a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il DPBS, poi utilizzare una punta di pipetta P1000, risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di coltura organoide a cellule T e posizionare la sospensione VEO sul ghiaccio finché i leccini T non sono pronti per la co-coltura. Per raccogliere le cellule T, controlla le cellule T a riposo al microscopio luminoso per valutare la dimensione e lo stato generale di salute. Confermare che le cellule T presentino un certo clustering, morfologia ingrandita e nessun detrito cellulare o frammenti visibili.
Utilizzando una pipetta P1000, sospendi le cellule T pipettando su e giù più volte in ogni angolo del pozzo. Raccogli una sonda conica e conteggi il numero totale di cellule T vive CD8. Successivamente, inserire la sospensione a cellule T nella centrifuga e girare a 584 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatant e risospendere il pellet delle cellule T in 10 millilitri di mezzo di coltura organoide per cellule T. Successivamente trasferisci il numero appropriato di cellule T nel tubo conico contenente i VO preparati in precedenza per combinare le cellule. Inserire la sospensione combinata VEO e T-cell nella centrifuga e girare di nuovo a 584 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il soprandante, risospendere i VEO e le cellule T nel volume appropriato di estratto della membrana basale. Poi, usando un'altra punta di pipetta, placca la sospensione sulla piastra di coltura tissutale preriscaldata, erogando 20 microlitri per pozzo per una piastra da 24 pozzi. Ora inverti la piastra di coltura tissutale e mettila a testa in giù in un incubatore a 37 gradi Celsius.
Prevedi 30 minuti per l'adesione completa dell'estratto della membrana basale e per la solidificazione. Dopo il periodo di incubazione, aggiungere con attenzione il mezzo completo di coltura organoide a cellule T integrato in ciascun pozzo. Erogare 500 microlitri per pozzo per una piastra da 24 pozzi oppure 250 microlitri per pozzo per una piastra da 96 pozzi, aggiungendo il materiale contro il lato del pozzo per evitare di disturbare la goccia estratta della membrana basale.
Sostituire il mezzo di coltura ogni due giorni fino al raccolto dei campioni per l'analisi della citometria a flusso. I VEO di topo di sette giorni fa infettati dal virus della coriomeningite linfocitaria che esprimono proteine fluorescenti gialle hanno mostrato un'abbondante replicazione virale già quattro ore dopo la co-coltura, visibile come segnali fluorescenti all'interno degli organoidi. L'accumulo di cellule T CD8 vicino agli organoidi infetti è diventato evidente in momenti successivi durante la co-coltura.
L'aggregazione progressiva delle cellule T CD8 è stata associata a una riduzione visibile del segnale proteico fluorescente giallo negli organoidi infetti in momenti successivi. I linfociti T CD8 co-colti con VEO infetti hanno mostrato un aumento dell'espressione di CD 69 e CD 103 nel tempo, indicando l'acquisizione di un fenotipo di memoria residente nel tessuto. I leccini T CD69 positivi ad antigene, CD103 positivi e CD8 hanno mostrato un aumento significativo della produzione intracellulare di interferone gamma e interleucina 2 rispetto ai controlli non stimolati.
Questo protocollo consente lo studio in vitro delle cellule T della memoria residenti CD8, consentendo una manipolazione efficiente delle cellule epiteliali e T senza dipendere da modelli animali. La sfida più importante in questo protocollo è mantenere sani e vitali cellule T e organoidi epiteliali vaginali, poiché la scarsa vitalità o l'infezione compromettono la sopravvivenza alla co-coltura e gli esiti sperimentali. Ci siamo concentrati sull'analisi citometrica a flusso, ma le co-colture possono essere raccolte per colorazione, imaging e sequenziamento.
Il supporto sicuro consente ELISA a valle.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra un metodo per studiare la differenziazione delle cellule T di memoria residenti CD8 utilizzando un sistema di co-coltura organoide-cellule T. Permette l'indagine delle risposte delle cellule T in un ambiente controllato in vitro, che è cruciale per comprendere le risposte immunitarie nel tratto riproduttivo femminile.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Scienza
- Immunologia
- Biologia delle Infezioni
- Tecniche di Coltura Cellulare
Sfondo
- Le cellule T CD8 svolgono un ruolo critico nelle risposte immunitarie.
- Le cellule T di memoria residenti sono essenziali per l'immunità a lungo termine.
- I metodi esistenti per studiare queste cellule hanno limitazioni.
- I modelli organoidi forniscono un ambiente più fisiologicamente rilevante.
Obiettivo dello Studio
- Sviluppare un sistema in vitro scalabile per studiare la differenziazione delle cellule T CD8.
- Valutare l'impatto delle infezioni sulla residenza e la funzione delle cellule T.
- Valutare l'acquisizione di marcatori delle cellule T di memoria residenti.
Metodi Utilizzati
- Isolamento delle cellule T CD8 dai topi.
- Co-coltura di cellule T con organidi epiteliali vaginali infetti.
- Analisi citometrica a flusso per valutare i marcatori delle cellule T.
- Monitoraggio della replicazione virale e delle risposte delle cellule T nel tempo.
Risultati Principali
- L'infezione degli organidi porta all'accumulo di cellule T.
- Le cellule T CD8 mostrano un'espressione aumentata di marcatori di memoria.
- Produzione significativa di citochine nelle cellule T stimolate.
- Questo metodo permette uno studio dettagliato del comportamento delle cellule T in vitro.
Conclusioni
- Il protocollo consente uno studio efficiente delle cellule T di memoria residenti CD8.
- Fornisce informazioni sulle risposte delle cellule T nel contesto delle infezioni.
- Questo approccio potrebbe ridurre la dipendenza dai modelli animali per la ricerca sulle cellule T.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Modeling CD8 T cell differentiation within a physiologically relevant epithelial organoid system addresses a critical gap in immune target validation for mucosal barrier tissues. This in vitro co-culture platform enables mechanistic de-risking of epithelial-T cell interactions, supporting predictive confidence in early immunology discovery and translational research. The approach offers scalable, reductionist analysis of tissue-resident memory T cell (TRM) biology, directly informing portfolio decisions in immunotherapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of epithelial-derived cues driving CD8 T cell differentiation.
- Supports functional validation of immune targets in a controlled, disease-relevant system.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating variables influencing TRM phenotype acquisition.
- Provides a platform for hypothesis-driven exploration of protective immunity mechanisms.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid-T cell co-cultures for downstream phenotypic and functional assays.
- Standardizes quantitative flow cytometry and cytokine readouts for reproducible immune profiling.
- Enables scalable screening of modulators affecting T cell residency and function.
- Supports assay development for compound evaluation in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mucosal tissue biology for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of immune targets by modeling infection-driven T cell responses.
- Supports biomarker discovery through quantitative analysis of TRM-associated markers and cytokines.
- Facilitates preclinical decision-making by providing mechanistic insights into tissue-specific immunity.
Pipeline & Workflow Integration
This co-culture system bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and functional immune target validation in a scalable in vitro format.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of epithelial signals in TRM differentiation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for immune phenotyping and cytokine analysis.
- Analytics: Delivers flow cytometry and ELISA-compatible readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Models infection-driven immune responses in barrier tissues for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse epithelial and T cell sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes co-culture and analytical workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of immune targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, T cell isolation, and co-culture techniques.
- Demands access to flow cytometry, imaging, and ELISA infrastructure for quantitative analysis.
- Necessitates cross-team standardization of cell viability and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial and T cell sources with protocol optimization.
- Dependent on maintaining high viability of both organoids and T cells for reliable outputs.
