Preparazione e elaborazione delle arterie calcificate con morfologia e RNA preservati per la profilazione spaziale digitale

La trascritomica spaziale offre un vantaggio sia rispetto al seq di RNA a singola cellula che su quello di RNA di massa, preservando le informazioni spaziali all'interno del tessuto. Utilizzando strumenti come RNAscope, deconvoluzione computazionale e dataset di singola cellulari disponibili pubblicamente, è possibile mappare il comportamento cellulare nei profili di nicchia e geni e costruire una visione integrata della biologia tissutale. Questa tecnologia sta esplodendo.

Due articoli di maggio 2025 su Nature si concentrano sugli studi sulla trascritomica spaziale. Se tracciamo PubMed, la curva è ancora più ripida: circa 150 articoli spaziali nel 2023, quasi 300 nel 2024 e in corsa di superare le 500 pubblicazioni nel 2025. La trasscrittomica spaziale ha già rimodellato diversi ambiti di ricerca importanti, come la biologia del cancro, le neuroscienze, l'immunologia e la biologia dello sviluppo.

Eppure la biologia vascolare è in ritardo. L'eterogeneità e la geometria unica di arterie e vene le rendono difficili per l'attacco tissutale e la conservazione dell'RNA. Inoltre, le lesioni vascolari avanzate presentano calcificazione e trombosi, che riducono ulteriormente l'integrità dei tessuti.

Questo protocollo è specificamente progettato per strutture simili a vasi. Includiamo inoltre metodologie per ridurre i costi e i processi di colorazione necessari per valutare RNA, deposizione di calcio e cellule di interesse. Data l'attuale scarsità di studi sulla trasscrittomica spaziale focalizzati sul vaso rispetto ad altri campi, questo protocollo è progettato per essere economico e adatto ai principianti, fornendo ai ricercatori vascolari strumenti accessibili per adottare la trasscrittomica spaziale nei loro studi.

Questo protocollo è anche potenzialmente utile per grandi campioni di coorte per esperimenti clinici. In questo protocollo, descriviamo procedure dettagliate che coprono la gestione accurata dei tessuti arteriali calcificati, metodi di calcificazione delle proprietà volti a preservare la qualità dell'RNA e la morfologia tissutale, tecniche di colorazione per la verifica e la guida durante la selezione del ROI, e la colorazione finale dei marcatori morfologici su vetrine preparate, assicurandosi che siano pronte per il processamento sullo strumento digitale di profiler spaziale. Le arterie tibiali umane, incluse le arterie tibiale anteriore, tibiale posteriore e perineale, sono state prelevate da campioni di amputazione del paziente e conservate in DMEM contenente 1% HEPES e 1%Pen-Streptococco.

Ogni arteria viene trasferita in una piastra di Petri da 100 millimetri con il mezzo. L'eccesso di tessuto connettivo perivascolare viene rimosso usando forbici sterili e pinze, lasciando solo la parete arteriosa. L'arteria tagliata viene trasferita in una nuova piastra di Petri.

All'interno della piastra viene preparato un tagliere sterile. Le arterie vengono tagliate in segmenti di un centimetro usando una lama chirurgica. Due segmenti di ciascuna arteria vengono congelati rapidamente in criotubi in azoto liquido per la crioconservazione e la conservazione per futuri lavori su proteine o RNA.

I segmenti rimanenti sono posti in tubi da 15 millilitri contenenti formalina tamponata neutra al 10% e fissati a quattro gradi Celsius per 24-48 ore. Si prepara la soluzione di decalcificazione con il 10% di EDTA in una soluzione stabilizzante dell'RNA, regolando il pH a 5,2 per la soluzione di lavoro. I tessuti fissi vengono trasferiti in un nuovo piatto contenente PBS e i tessuti vengono brevemente lavati.

Ogni campione viene trasferito in un tubo da 15 millilitri contenente una soluzione di decalcificazione e agitato a quattro gradi Celsius per 72 ore. Dopo il completamento della decalcificazione, i campioni vengono lavati due volte con PBS con una delicata agitazione per cinque minuti. I tessuti vengono trasferiti in cassette.

Le cassette vengono inserite in un processore di tessuti. La lavorazione della formalina viene effettuata per almeno quattro ore. Il tempo può variare a seconda della matrice campionaria.

Vengono posizionati più segmenti di arterie per ogni blocco. Il blocco viene riempito di paraffina e lasciato raffreddare completamente. I vetrini vengono preparati segnando l'area di tessuto ristretta sul retro dei carrelli.

Confermare che tutti i segmenti rientrino nell'area limitata richiesta dallo strumento GeoMx DSP. La paraffina in eccesso viene rimossa dai blocchi. I blocchi vengono poi sezionati a cinque micron con lame a profilo basso.

I nastri di tessuto sono montati all'interno dell'area contrassegnata. Almeno quattro sezioni seriali per blocco sono montate per diverse colorazioni nell'esperimento DSP. Conserva i vetri a quattro gradi Celsius fino all'uso.

Successivamente, l'ibridazione in situ con RNAscopio, così come la colorazione istologica, vengono eseguite su vetrine preparate serialmente. Inoltre, un altro set di vetrine è colorato con marcatori morfologici, come CD45 per le cellule immunitarie e alfa-SMA per le cellule muscolari lisce. La procedura di ibridazione in situ RNAscope consiste brevemente in quattro fasi principali: cottura a vetrina come pretrattamento, deparafinizzazione e reidratazione standard, recupero del bersaglio, ibridazione della sonda con amplificazione del segnale e colorazione del colorante per la visualizzazione dell'RNA.

Per la validazione istologica, vengono eseguite sia la colorazione H&E che la colorazione con Alizarin Red S per consentire la localizzazione precisa dei depositi di calcio. Infine, la colorazione morfologica dei marcatori viene eseguita con un protocollo immunoistochimico standard per identificare le cellule di interesse, guidando la selezione del ROI. In questo studio sono stati confrontati due protocolli basati su EDTA: uno, 10% EDTA da solo per 72 ore, e due, 10% EDTA e soluzione stabilizzante RNA per la stessa durata.

Morfologia e qualità dell'RNA sono state valutate tramite ibridazione in situ tramite RNAscope. Entrambi i metodi hanno preservato l'architettura dei vasi, ma i vetrini trattati con EDTA e cocktail di soluzioni stabilizzanti di RNA hanno mostrato segnali di RNA nettamente più forti, come dimostrato nel pannello destro, indicando che la soluzione stabilizzante di RNA protegge i trascritti mentre l'EDTA chela il fosfato di calcio cristallino e ammorbidisce gradualmente il campione senza attivare le RNasi. Con la strategia di conservazione dell'RNA ottimizzata e la qualità confermata, dimostriamo i passaggi per la colorazione istologica per la deposizione di calcio utilizzando ematossilina ed eosina e Alizarina Rossa S. L'alizarina lega selettivamente i sali ionici di calcio e cambia tonalità da arancione a rosso mattone, evidenziando sensibilmente micro e macro calcificazioni, anche se fornisce meno dettagli nella matrice cellulare ed extracellulare rispetto a H&E.

L'uso di entrambe le colorazioni massimizza le informazioni strutturali e composizionali. Dopo la colorazione morfologica dei marcatori, le diapositive vengono scansionate sulla piattaforma GeoMx. L'anticorpo CD45 segna le cellule immunitarie, mentre l'actina del muscolo liscio alfa marca le cellule muscolari lisce vascolari abbondanti nel mezzo.

I ROI selezionati comprendono circa 100-150 nuclei con una resa adeguata di RNA. I ROI sono stati posti adiacenti e distanti dalle aree calcificate per confrontare i modelli di espressione genica spaziale rilevanti per la calcificazione mediale dell'arteria tibiale. Nonostante una certa perdita tissutale durante le fasi di elaborazione di più ore, sono stati identificati diversi ROI adatti in ciascuna sezione dell'arteria.

Per concludere, questo flusso di lavoro copre la gestione del tessuto arteriano calcificato e la decalcificazione attraverso la colorazione di validazione e la selezione del ROI per uno studio di trascritomica spaziale. In particolare, combinare H&E con la colorazione specifica per calcio con Alizarina garantisce una localizzazione precisa della calcificazione vascolare e massimizza sia le informazioni strutturali che composizionali per il posizionamento del ROI. L'analisi RNAscope mostra che le sezioni arteriose decalcificate rimangono in gran parte intatte con sufficiente RNA.