Dissezione dei muscoli di volo indiretti di Drosophila melanogaster per approcci di microscopia

Studiamo lo sviluppo muscolare, in particolare, come la regolazione dell'RNA contribuisca alla formazione dei sarcomeri e alla funzione specifica dei tipi di fibre in Drosophila melanogaster. I muscoli indiretti del volo si assemblano durante lo sviluppo della pupa. Per seguire questo processo in vivo è necessario sviluppare e ottimizzare protocolli di dissezione tecnicamente impegnativi.

Per cominciare, posiziona un vetrino del microscopio sotto un microscopio stereo dissezionante. Usa una pipetta di plastica per trasferire una goccia di PBS sul vetrino. Con un pennello o un paio di pinze, trasferire il campione di Drosophila in piccoli gruppi fino a una goccia di PBS.

Poi, usa un paio di forbici a molla Vannas per rimuovere testa, ali e addome, lasciando le gambe attaccate. Ora, trasferisci delicatamente i thorace a 500 microlitri di soluzione di fissazione in un pozzetto di una piastra da 24 pozzi con l'aiuto di una spazzola. Posiziona la piastra su un nutator o su un oscillatore e fissa per la durata desiderata, tipicamente tra 15 e 60 minuti.

Con una pipetta da P1000 microlitri, rimuovi il tampone dal pozzo. Inserire una goccia dello 0,05% PBS con Triton X-100 su un vetrino al microscopio sotto un microscopio stereo dissezionante. Poi, usa una spazzola o una pinza per trasferire i toraci nella goccia PBST.

Orientare il torace con lo scutello rivolto verso l'alto e stabilizzarlo tra una coppia di pinze Dumont 3. Successivamente, fai scorrere una lama criostatica sul torace per intagliare lo scutellolo. Poi, taglia in un unico movimento liscio e verso il basso lungo la linea mediana per creare l'emisezione del torace ed esporre i muscoli indiretti del volo.

Utilizzando le pinze, trasferire le emisezioni toraciche dal vetrino al microscopio a 500 microlitri di PBST allo 0,05% in un pozzetto di una piastra a 24 pozzi per ulteriori lavorazioni. Per eseguire la dissezione dei muscoli indiretti del volo pupale, raccogliere l'età pre-pupa al momento corretto su una carta filtrante bagnata. Per le dissezioni di emitorax pupali, si posiziona una striscia di nastro adesivo doppio adesivo a un vetrino microscopico sotto un microscopio stereo dissezionante con un ingrandimento da 10X a 20X.

Nel momento desiderato, usa un pennello per trasferire le pupe dalla carta filtrante al nastro. Usa un paio di 5 pinze per aprire la parte anteriore della capsula pupale e rimuovere delicatamente l'opercolo. Tagliare con cura il lato dorsale della pupa e staccarlo a intervalli di 1-2 millimetri.

Una volta liberata dalla custodia pupale, trasferire delicatamente la pupa su una goccia di PBS su un secondo vetrino al microscopio. Ora, usa le forbici a molla Vannas per rimuovere l'addome. Usando una spazzola o una pinza, trasferisci la testa e il torace a 500 microlitri di soluzione di fissazione in un pozzo di piastra a 24 pozzi.

Dopo la fissazione e la rimozione della soluzione di fissazione, trasferire i toraci in una goccia dello 0,05% di PBST su un vetrino microscopico. Separare un torace dagli altri e orientarlo dal lato ventrale verso il basso, stabilizzato tra le pinze Dumont 3. Fai scorrere una lama criostatica sul torace finché la membrana basale e la cuticola non si aprono a fessura.

Poi, taglia verso il basso con un solo movimento liscio e verso il basso lungo la linea mediana per generare emisezioni toraciche ed esporre i muscoli indiretti del volo. Usa un pennello o una pinza per trasferire emisezioni a 500 microlitri di PBST allo 0,05% in una piastra a 24 pozzi per ulteriori tintine. Per la dissezione a libro aperto dei muscoli di volo indiretti, trasferire le pupe in un piatto disezionale nero in silicone riempito di PBS dopo averle rimosse dalla custodia pupale.

Utilizzando la pinza Dumont 5, premi delicatamente le pupe dissezionate sulla superficie del piatto e inserisci due aghi a forma di insetti attraverso l'addome di ogni pupa per fissarle in linea. Usando forbici a molla Vannas, si apri la membrana basale e la regione anteriore della testa di ogni pupa. Ora, inserisci le forbici nell'apertura e taglia lungo i lati della pupa.

Usa le pinze per sollevare e rimuovere la parte ventrale con le forbici. Poi, rimuovere il cervello, il cordone nervoso ventrale, la trachea e l'intestino. Usa una pipetta da 200 microlitri con punta tagliata per pipettare delicatamente PBS sul torace e rimuovere i corpi grassi residui.

Poi, usa un paio di forbici a molla Vannas per tagliare la linea mediana del torace dorsale e creare due foglioline contenenti muscoli di volo indiretto. Taglia le foglioline del torace dorsale lontano dall'addome e trasferiscile in 300 microlitri di soluzione fissativa in una piastra di vetro nera usando pinze Dumont 5. Dopo aver fissato per il tempo opportuno, usa una pipetta per rimuovere il fissativo e lava 500 microlitri di PBST allo 0,05% prima dell'immunocolorazione.

Una volta completata l'immunocolorazione, si pipetta la miscela secondaria o di colorazione. Poi, lavare i campioni quattro volte per 10 minuti ciascuno in soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,05% con Triton X-100 a temperatura ambiente. Etichetta l'area scavata di un vetrino con il numero di campione o le informazioni identificative, come data, genotipo, anticorpo o numero di vetrina.

Pipetta una goccia di glicerolo sul vetrino del microscopio per fissare i distanziatori. Poi, posiziona 1 distanziatori di copertura sul vetrino del microscopio a circa 1 centimetro di distanza. Ora, aggiungi una goccia di mezzo di montaggio tra i distanziatori.

Pipetta via eventuali residui di buffer di lavaggio e trasferisci immediatamente i campioni nel mezzo di montaggio. Utilizzando le pinze Dumont 5, organizza i campioni in file e colonne non sovrapposte con i muscoli indiretti del volo rivolti verso l'alto. Aggiungi con attenzione una copertura 1 sopra i campioni.

Successivamente, riempire l'area campionaria con un mezzo di montaggio finché tutti i thorace non sono chiusi. Poi, usa dello smalto trasparente per sigillare sia il copertino del campione che quello del distanziatore. La morfologia del sarcomero è stata efficacemente preservata con il 4% di paraformaldeide, ma si è osservata una differenza significativa nella larghezza del sarcomero tra paraformaldeide e PBS rispetto alla soluzione rilassante.

La fissazione del metanolo ha preservato le strutture di miofibra e sarcomero, ma i sarcomeri erano significativamente più corti e sottili rispetto alla fissazione al 4% di PFA. La fissazione del gliosside ridusse significativamente la larghezza del sarcomero rispetto al 4% di paraformaldeide. La fissazione per 15 o 30 minuti ha preservato la struttura del sarcomero, ma una fissazione di sette minuti ha prodotto morfologie incoerenti.

La struttura miofibrillica dei muscoli indiretti del volo appare sfilacciata e lacerata a causa di lame smussate o scivolamenti della lama. Le pinze a contatto diretto con i muscoli causavano cavità o allungamento, separando i sarcomeri. Lo stiramento o la deformazione del torace hanno causato la perdita del disco Z.

Segare le fibre causava lo sfilo. A 72 ore dalla formazione del pupario e dall'età adulta, i mutanti di SmnE33 erano privi di sarcomeri, con fasci di F-actin e starburst ridotti. A 26 ore dalla formazione del pupario, SmnE33 e i controlli mostravano cavi e reti mesh simili di SmnE33.

Abbiamo ricevuto protocolli per la microscopia immunofluorescenza dei muscoli indiretti del volo già 16 ore dopo la formazione del pupario, fino allo sviluppo tardo della pupa fino allo stadio adulto. Il nostro protocollo ci permette di esaminare i fenotipi molecolari e i deficit cellulari in relazione alla localizzazione delle proteine e alla struttura e funzione muscolare che di solito portano a deficit comportamentali.