Name: Shrinky-Dink Hanging Gocce: un modo semplice per forma e cultura corpi embrionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri un metodo semplice e rapido per caricare un numero predefinito di cellule in micropozzetti per la formazione di corpi embrionali. Questa tecnica riduce il lavoro manuale rispetto al metodo hanging drop tradizionale.

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Vorremmo ringraziare CIRM per il supporto di questo lavoro. La linea cellulare è stata generosamente donata dal Dott. Andras Nagy al Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.

1. Fare Shrinky-Mold Dink <ol><li> Stampare il modello voluto sulla Shrinky-dink foglio utilizzando una stampante buona definizione. </li><li> Cuocere Shrinky-dink foglio a 163 ° C per circa 10 minuti, o fino a completo ristretto e aver acquisito una forma regolare. </li><li> Dopo Shrinky-dink stampo è raffreddato, immergere in un bagno di isopropanolo fino a quando l&#39;intera superficie è a malapena coperto. </li><li> Attenzione, spray alcuni acetone sopra lo stampo e agitare il contenitore un paio di volte. Aggiungere più isopropanolo per lavare l&#39;eccesso di acetone e ripetere l&#39;operazione un paio di volte fino a quando Shrinky-muffa sembra pulito. </li><li> Stampo immergere in acqua distillata per 10 minuti per lavare la parte rimanente solvente organico. </li><li> Aria pulita Shrinky-stampo. Ri-calore per circa 5 minuti a 163 ° C. Questo inchiostro compatta e far evaporare i solventi rimanenti. </li></ol> 2. Fare PDMS pozzetti <ol><li> Preparare una miscela 10:01 agente PDMS / indurimento ed agitare vigorosamente per pochi minuti. </li><li> Luogo Shrinky-dink stampo in una piccola scatola di Petri. Versare il composto PDMS fino a raggiungere circa 1 / 2 cm su tutta la superficie dello stampo. </li><li> Piatto posto sotto campana sottovuoto per eliminare tutte le bolle dalla miscela PDMS. </li><li> Piatto posto in forno a 70 ° C, durante la notte. </li><li> Tagliare solido PDMS da muffe e associarlo a un vetrino semplicemente applicando una pressione. </li><li> Eliminare prima micropozzetti-chip, dal momento che ha i residui di inchiostro incrostato tra PDMS. </li><li> Ripetete questa procedura per produrre un secondo chip che è inchiostro libero e ha una forma più definita. </li><li> Pulire micropozzetti chip usando la soluzione di etanolo al 70%. Posto sotto fonte di luce UV per 10 minuti per sterilizzarlo. </li></ol> 3. Cellule cattura in pozzetti <ol><li> Contare le celle e diluire in terreni di coltura alla concentrazione desiderata (a seconda del numero delle cellule iniziali in pozzi che si desidera). Per esempio, per ottenere circa 10-15 cellule per pozzetto (media = 11, SD = 5.4, tasso di carico = 93%), abbiamo usato una concentrazione di 8 × 10 4 cellule / ml. Per una concentrazione di 17 × 10 4 cellule / ml, si potrebbe ottenere affidabile tra 25 e 35 cellule per pozzetto (media = 27,17857 DS = 7.7, tasso di carico = 100%). </li><li> Attentamente luogo di chip micropozzetti in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente una base solidificato PDMS. </li><li> Aggiungere circa ml 2JDP della soluzione di cellula. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 760 giri al minuto e 4 ° C. </li><li> Pipettare in eccesso di soluzione e lavate accuratamente micropozzetti con la soluzione PBS 1X. </li><li> Mettere in un piatto micropozzetti Petry piccolo, facendo attenzione tenendo il chip dalla provetta. </li><li> Lavare l&#39;eccesso di cellule con 1 X soluzione PBS. </li><li> Luogo di chip micropozzetti sotto un microscopio invertito per verificare il numero previsto di cellule per pozzetto. </li><li> Incubare micropozzetti contenenti cellule in condizioni standard. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Figura-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Incubazione delle cellule <ol><li> Seguire il protocollo normale EB in laboratorio. </li><li> Cambia il medium lentamente dal lato della camera, non disturbare la cella nel micropozzetti. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Abbiamo sviluppato un metodo cultura semplice, rapida e scalabile per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione (stampato da Shrinky-Dinks) e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali. Infine, queste cellule sono facilmente accessibili per ulteriori analisi e sperimentazione. Questo metodo è suscettibile di ogni laboratorio e non richiede attrezzature dedicate perché abbiamo ovviare alla necessità di fotolitografia. Siamo in grado di variare la dimensione dei pozzetti così come la concentrazione di cellule...

Per i media Mesc (McCloskey laboratorio di protocollo): (per i media totale preparato: 50ml, 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1ml 2mM L-glutammina: 0,5 ml; 1ml NEAA: 0,5 ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul diluito BME:. 50ul; 100ul (Aggiungi 35ul di sterile BME filtrato a 5 ml di PBS e siringhe filtro sterilizzare Scartare dopo 2 settimane. Concentrazione finale della soluzione è 0,1 mM)

shrinky-dink hanging gocce: un modo semplice per forma e cultura corpi embrionali

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Corpi embrionali (EB) sono aggregati di cellule staminali embrionali. Il modo più comune di creare questi aggregati è il metodo goccia, un approccio laborioso di pipettaggio un numero arbitrario di celle in piastre. Le interazioni tra le cellule staminali costretti a stretta vicinanza l&#39;uno dall&#39;altro favorisce la generazione di EBS. Perché i media in ciascuno dei pozzi deve essere manualmente scambiati ogni giorno, questo approccio è manualmente intensiva. Inoltre, poiché i parametri ambientali, tra cui cellula-cellula, cellula-interazioni tra fattori solubili, pH, ossigeno e la disponibilità possono essere le funzioni di taglia EB, popolazioni di cellule ottenute dalle tradizionali gocce può variare notevolmente, anche se colto in condizioni identiche. Recenti studi hanno infatti dimostrato che il numero iniziale di cellule che formano l&#39;aggregato possono avere effetti significativi sulla differenziazione delle cellule staminali. Abbiamo sviluppato un metodo cultura semplice, rapida e scalabile per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali. Infine, queste cellule sono facilmente accessibili per ulteriori analisi e sperimentazione. Questo metodo è suscettibile di ogni laboratorio e non richiede apparecchiature dedicate. Dimostriamo questo metodo mediante la creazione di corpi embrionali utilizzando una linea cellulare rosso fluorescente mouse (129S6B6-F1).

Mostriamo un metodo semplice e rapido per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali.

Shrinky-Dink Hanging Gocce: un modo semplice per forma e cultura corpi embrionali

I corpi embrioidi (EB) sono aggregati di cellule staminali embrionali. Il metodo più comune per creare questi aggregati è la tecnica della goccia sospesa, un processo laborioso...

Le embrioidi sono aggregati di cellule staminali embrionali. Il metodo più comune per creare questi aggregati è il metodo della goccia sospesa. Un approccio laborioso che prevede la pipettaggio di un numero arbitrario di cellule in piastre a pozzetti.Il processo richiede un notevole intervento manuale poiché ogni giorno è necessario sostituire manualmente il mezzo e ogni piastra di coltura. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che il numero iniziale di cellule che formano l'aggregato può influenzare la differenziazione delle cellule staminali. Con questo metodo, non è possibile predeterminare il numero di cellule.In questo video, mostriamo un metodo semplice e rapido per caricare diverse quantità di cellule in pozzetti microfabbricati per lo sviluppo di embrioidi. Ciao, sono Jonathan Pagan del laboratorio di Michelle K presso la School of Engineering dell'Università della California di Merced, e sono Jesus Luna, anch'io del laboratorio di K. Oggi vi mostreremo una procedura per creare embrioidi in pozzetti microfabbricati mediante centrifugazione.Questa procedura comprende i seguenti passaggi: creare un microdispositivo, caricare le cellule staminali e nutrire le cellule staminali. Cominciamo. Il primo passaggio di questa procedura consiste nel realizzare il mold in shrinky dink utilizzando una stampante ad alta definizione.Stampare il modello desiderato su fogli di shrinky dink. Successivamente, cuocere il foglio shrinky D a 160 gradi Celsius per circa 10 minuti o fino a quando si sarà completamente ridotto e avrà assunto una forma regolare. Dopo che il modulo di stampa per inchiostro ridotto si sarà raffreddato per due minuti ed sarà freddo al tatto.Immergerlo in un bagno di isopropanolo fino a quando l'intera superficie è appena coperta. Dopo aver immerso il calco di inchiostro restringente nell'isopropanolo, spruzzare con attenzione un po' di acetone sul calco e agitare il contenitore alcune volte. Quindi aggiungere altro isopropanolo per eliminare l'eccesso di acetone e ripetere questo passaggio diverse volte finché il calco di inchiostro restringente non appare pulito.Successivamente, immergere lo stampo e l'acqua distillata per 10 minuti per rimuovere eventuali solventi organici residui. Dopo l'immersione in acqua, asciugare lo stampo dell'inchiostro termoretraibile utilizzando aria compressa e riscaldarlo nuovamente per circa cinque minuti a 160 gradi Celsius. Questo processo compatterà l'inchiostro ed evaporerà qualsiasi solvente residuo.E ora possiamo procedere alla realizzazione dei micropozzi in PDMS. Ora generiamo i micropozzi in PDMS, che verranno utilizzati per coltivare le cellule staminali per lo sviluppo dell'embryoid body. Preparare una miscela di PDMS e agente indurente in rapporto 10 a 1 e agitare vigorosamente per alcuni minuti.Successivamente, versare la miscela di PDMS sullo stampo in shrinky dink all'interno di una piccola piastra di Petri fino a raggiungere uno spessore di circa mezzo centimetro sopra la superficie dello stampo. Dopo il travaso, è comune osservare bolle di aria sulla superficie dello stampo; per eliminarle, posizionare la piastra sotto una campana a vuoto per 20 minuti al fine di rimuovere completamente le bolle dalla miscela di PDMS.Dopo aver verificato che tutte le bolle siano state eliminate, posizionare la piastra in forno a sette gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere il PDMS solido dallo stampo con una lametta. Pulirlo utilizzando del nastro adesivo e fissarlo su un vetrino con le cavità rivolte verso l'alto.Questo viene fatto semplicemente applicando pressione sui bordi. Successivamente, pulirlo utilizzando una soluzione di etanolo al 70% e posizionarlo sotto una sorgente di luce UV per 10 minuti, al fine di sterilizzarlo.La prima volta che esegui questa procedura, dovrai scartare il PDMS. Questo aiuterà a rimuovere eventuali residui di inchiostro in eccesso dallo stampo. Successivamente, potrai utilizzare lo stampo così com'è.Ripetere nuovamente la procedura di modellatura per produrre un secondo chip privo di inchiostro e con una forma più definita. Assicurarsi di applicare una scarica per 20 secondi prima di iniziare, al fine di creare una superficie idrofila che faciliti il caricamento. Dopo aver realizzato i micropozzetti in PMS, questi possono ora essere utilizzati per lo studio dei corpi di Enid.Procediamo dunque. Per iniziare, le cellule devono essere contate e diluite nel mezzo di coltura cellulare alla concentrazione desiderata, che dipende dal numero di cellule iniziali che si desidera ottenere nei pozzetti. Alla concentrazione di 1,5 × 10⁴ cellule per millilitro, abbiamo osservato che si ottengono 14 cellule per pozzetto in ogni pozzetto caricato.Aggiungere due millilitri di soluzione cellulare in un tubo da centrifuga da 50 millilitri contenente una base di PDMS solidificata. Posizionare con attenzione il chip a micropozzetti nel tubo da centrifuga e centrifugare per cinque minuti a 760 giri al minuto. Successivamente, asportare il mezzo con una pipetta e posizionare il micropozzetto in una piccola capsula di Petri.Attenzione a non versare mentre si estrae il chip dal tubo della centrifuga. Successivamente, posizionare il chip con pozzetti microscopici sotto un microscopio invertito per verificare che ogni pozzetto sia stato caricato. Inserire il chip nel supporto e incubare i pozzetti microscopici contenenti le cellule in condizioni standard per 24 ore.Per mantenere le cellule, il mezzo può essere sostituito lentamente dal lato della camera dopo 24 ore. Evitare di disturbare le cellule nel micropozzetto; è possibile eseguire questa operazione ogni giorno.Il bello è che si pipetta una sola volta e si cambia tutto il mezzo, a differenza del metodo convenzionale delle gocce sospese, in cui è necessario sostituire il mezzo per ciascun pozzetto. Abbiamo appena mostrato come coltivare cellule e creare corpi in rilievo utilizzando stampi in shrinky dink. Questo metodo è estremamente utile perché è semplice, rapido e richiede meno manipolazioni manuali rispetto al metodo della goccia sospesa. Inoltre, questo metodo non richiede fotolitografia.Inoltre, possiamo controllare il numero di cellule di partenza per i nostri corpi ricamati. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo video mostra come condurre differenziamento in vitro di cellule staminali embrionali di topo di corpi embrionali usando il metodo goccia pendente.

La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia

Descriviamo un metodo semplice, rapido di generare 3D tessuti come sferoidi e la loro potenziale applicazione di quantificare le differenze nelle interazioni cellula-cellula.

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Questo video mostra un test per generare organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Le iPSC umane sono indotte a formare corpi embrioidi (EB). Gli EB vengono coltivati su un'impalcatura polimerica utilizzando un mezzo di induzione, promuovendo la differenziazione in cellule staminali neurali, cellule progenitrici e neuroni immaturi. Infine, gli EB vengono incorporati in una matrice e trasferiti in un mezzo di mantenimento per la formazione di organoidi cerebrali.

Generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo video mostra il processo di generazione di sfere neuronali utilizzando una tecnica di coltura a goccia sospesa. All'interno delle gocce sospese, le cellule si muovono verso il basso, autoassemblate in strutture tridimensionali che formano sfere di neuroni, che possono essere utilizzate per studi neurobiologici.

Sviluppo di sfere neuronali utilizzando una tecnica di coltura a goccia sospesa

Il video dimostra la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo (mESC) in corpi embrioidi (EB) con il metodo della goccia sospesa. Dopo aver sospeso le mESC in gocce sospese e incubate, le cellule si aggregano per formare EB, che vengono ulteriormente differenziate in cellule progenitrici neuronali (NPC) utilizzando un mezzo di differenziazione integrato con acido retinoico (RA).

Generazione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali di topo con il metodo della goccia sospesa

Questo video mostra l'utilizzo di una tecnica di illuminazione laterale a luce soffusa per migliorare la visualizzazione ad occhio nudo dei corpi embrioidi, facilitando così la loro manipolazione e il loro trasferimento durante la coltura di organoidi cerebrali. Chiarisce l'impostazione dell'illuminazione a luce soffusa, i metodi per i cambiamenti dei media e il trasferimento del corpo embrioide, nonché la procedura per indurre la differenziazione neurale nei corpi embrioidi per lo sviluppo di...

Una tecnica per ottimizzare la coltura di organoidi cerebrali utilizzando l'illuminazione laterale a luce soffusa

La coltura di goccioline verticali ex vivo è un'alternativa alle attuali tecniche sperimentali in vitro e in vivo. Questo protocollo è facile da eseguire e richiede piccole quantità di reagente, consentendo al contempo la capacità di manipolare e studiare la vascolarizzazione, la morfogenesi e l'organogenesi fetale.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Qui descriviamo un protocollo per generare organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). Questo protocollo genera organoidi renali entro due settimane. Gli organoidi renali risultanti possono essere coltivati in fiaschi spinner su larga scala o piastre magnetiche multi-pozzo per approcci paralleli di test antidroga.

Un metodo semplificato per la generazione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane

Gli organoidi cerebrali offrono opportunità senza precedenti per lo studio dello sviluppo degli organi e della patologia delle malattie umane. Sebbene sia stato ottenuto un grande successo con i sistemi di coltura di organoidi cerebrali, ci sono ancora difficoltà operative nell'applicazione di questa tecnologia. Il presente protocollo descrive una procedura organoide cerebrale che facilita il cambiamento del mezzo e il trasferimento degli organoidi.

Facilitare la coltura di organoidi cerebrali tramite illuminazione laterale a luce soffusa

Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la generazione, il mantenimento e l'invecchiamento riproducibili di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC). Questo metodo consente di coltivare e maturare organoidi cerebrali per periodi prolungati, il che facilita la modellazione dei processi coinvolti nell'invecchiamento cerebrale e nella patogenesi legata all'età.

Fabbricazione di tessuti robusti per la coltura a lungo termine di organoidi cerebrali derivati da iPSC per la ricerca sull'invecchiamento

Qui, introduciamo un protocollo completo per la generazione e l'analisi a valle di organoidi cerebrali umani utilizzando il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e a singolo nucleo.

Generazione e analisi a valle di trascrittomi a singola cellula e a singolo nucleo in organoidi cerebrali

Scopri un metodo semplice e rapido per caricare un numero predefinito di cellule in micropozzetti per la formazione di corpi embrionali. Questa tecnica riduce il lavoro manuale rispetto al metodo hanging drop tradizionale.

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