Un modello murino neonatale di enterocolite necrotizzante e isolamento della lamina propria per la profilazione delle cellule immunitarie

La nostra ricerca si concentra sulla malattia che colpisce i neonati fragili dal punto di vista medico chiamata enterocolite necrotizzante. Miriamo a scoprire i meccanismi coinvolti nella risposta immunitaria nella NEC e a sviluppare strategie per la diagnosi precoce e la prevenzione della malattia. È molto difficile studiare le risposte delle cellule immunitarie intestinali nella NEC neonatale. Il nostro protocollo colma questa lacuna dimostrando come isolare le cellule immunitarie della lamina propria per l'analisi tramite citometria di flusso.

Per cominciare, acquisire una coltura di batteri enterici da un neonato con enterocolite totalis necrotizzante, o NEC. Nel giorno sperimentale 0 alle 15:00, pipetta una aliquota da 20 microlitri della coltura in un tubo da 15 millilitri contenente 2 millilitri di brodo Luria-Bertani. Incubare la coltura batterica a 37 gradi Celsius per 16 ore in uno shaker orbitale impostato a 1G, assicurandosi che il coperchio del tubo sia mantenuto in posizione ventilata.

Contemporaneamente, incubare un secondo tubo di coltura contenente solo 2 millilitri di brodo Luria-Bertani come controllo per verificare eventuali contaminazioni. Il giorno seguente alle 7:00, pipettare 125 microlitri della coltura batterica notturna in una fiaschetta di coltura T75 con coperchio ventilato contenente 25 millilitri di brodo Luria-Bertani. Preparare un totale di quattro fiaschette T75 e incubare in posizione verticale a 37 gradi Celsius per due ore in uno shaker orbitale impostato a 1G.

Alle 9:00 dei giorni sperimentali 1, 2 e 3, si combinano 16 millilitri di latte artificiale con 8 millilitri di latte artificiale in un tubo centrifuga sterile da 50 millilitri per preparare la miscela di latte artificiale. Rimuovere il sovrantato da due tubi centrifughe da 50 millilitri contenenti la coltura batterica a pellet. Sospezione accurata ciascuno dei due pellet in 2 millilitri della miscela preparata.

Successivamente trasferisci entrambe le miscele risospese nella miscela rimanente per creare un totale di 24 millilitri di formula NEC. Etichetta sei tubi centrifughe da 50 millilitri con i sei punti di alimentazione del tempo. Pipetta 4 millilitri della formula NEC in ciascuno dei sei tubi etichettati.

Successivamente, prepara sei aliquote monouso di calcio lipopolisaccaridico a 5 milligrammi per millilitro e conserva in microtubi a basso legame a 20 gradi Celsius. Poco prima di allattare, scongelare un lipopolisaccaridico aliquota e un vortice per 15 secondi. Aggiungi un volume calcolato del lipopolisaccaride a un tubo da 4 millilitri con formula NEC e mescola bene pipettando.

Riempi una siringa da 1 millilitro con la formula NEC preparata e collegala a una linea PICC neonatale. Per somministrare la formula NEC a ciascun cucciolo tramite gavage orali, trattieni delicatamente il cucciolo con la pelle flaccida alla base del collo e tienilo dritto. La distanza di inserimento della linea PICC è uguale alla distanza dall'angolo della bocca fino alla parte superiore della macchia di latte nello stomaco.

Il punto di inserimento ottimale sulla linea PICC dovrebbe essere segnato con un pennarello permanente. Con la pinza, guida la linea PICC nell'orofaringe e poi verso lo stomaco. Se si riscontra resistenza, rimuovere la linea PICC, riposizionarla e tentare di reinserirla.

Somministra lentamente 80 microlitri di formula NEC nello stomaco. Monitora il cucciolo per eventuali segni di aspirazione durante l'alimentazione. Dopo l'alimentazione, rimuovere la linea PICC e osservare il cucciolo per eventuali difficoltà respiratorie o vomito.

Se avviene il rigurgitazione, tampona la bocca e il naso del cucciolo con una salvietta da laboratorio a basso contenuto di pelucchio. Ripeti il processo di alimentazione in tutti i momenti del pasta. Al quarto giorno sperimentale, prelevare il tessuto intestinale dai topi neonatali eutanasiati.

Con un paio di forbici, taglia l'intestino longitudinalmente per aprirlo, poi sezionalo trasversalmente in segmenti da 1 a 1,5 centimetri. Trasferire i segmenti intestinali in un tubo centrifugo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione predigestione raffreddata sul ghiaccio. Poi incubare il tubo a 37 gradi Celsius con rotazione continua per 20 minuti per iniziare la dissociazione del tessuto.

Fai ruotare delicatamente il tubo per slogare il tessuto allentato, poi versa il contenuto attraverso un colino a celle da 100 micrometri posizionato sopra un tubo centrifuga da 50 millilitri. Trasferire i frammenti di tessuto rimanenti in un nuovo tubo centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione digertiva preriscaldata a 37 gradi Celsius. Incubare il campione con rotazione continua per 40 minuti a 37 gradi Celsius.

Poi trasferisci il contenuto in un tubo di dissociazione tissutale automatico. Esegui il programma con quattro cicli di rotazione alternati da 15 secondi in senso orario e antiorario. Quando la dissociazione è completata, si vortiza delicatamente la sospensione cellulare nel tubo di dissociazione e poi centrifugala a 300G per 5 minuti a 4 gradi Celsius.

Aspira con cura il soprandanante senza disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 1 millilitro di buffer cellulare attivato a fluorescenza fredda come ghiaccio. Posizionare un colino a celle da 100 micrometri su un tubo centrifuga da 50 millilitri.

Trasferire le cellule risospese attraverso il colino e lavarle con 2 millilitri di tampone di selezione cellulare attivata a fluorescenza fredda. Contare le cellule isolate e valutare la vitalità usando il blu di tripano o un colorante di vitalità. Centrifuga il volume desiderato per la citometria di flusso a 300G per 5 minuti a 4 gradi Celsius.

È stata osservata una significativa riduzione della sopravvivenza nel gruppo trattato con NEC rispetto ai controlli alimentati dalla diga. L'esame intestinale grossolano dei topi NEC ha mostrato caratteristiche distintive della NEC, inclusi segni visibili di distensione, accumulo d'aria e pneumatosi intestinale rispetto ai controlli sani. La colorazione di ematossilina ed eosina ha rivelato una distruzione villosa a chiazze e una compromessa dell'architettura intestinale nei topi NEC rispetto ai villi intatti nei controlli.

L'espressione di RNA messaggero di IL1B, CXCL2 e LCN2 è stata significativamente più alta nel gruppo NEC rispetto ai controlli. Il totale delle cellule immunitarie CD45+ nella lamina propria intestinale non è stato significativamente diverso tra i gruppi NEC e di controllo. I livelli di macrofagi erano significativamente elevati nell'intestino NEC rispetto ai controlli.

I topi NEC hanno mostrato una proporzione aumentata di cellule mieloidi, in particolare monociti e macrofagi, rispetto ad altri sottotipi immunitari. Gli approcci multiomici a singola cellula stanno scoprendo firme immunitarie nel NEC, offrendo nuove intuizioni sui meccanismi e sui potenziali biomarcatori. Modellare la NEC è difficile perché la malattia è multifattoriale.

Replicare l'ambiente intestinale umano, le risposte immunitarie e le influenze microbiche nei topi neonatali richiede un'ottimizzazione accurata. Il nostro modello integra microbioma di origine umana, ipossia e alimentazione con formula, rendendolo fisiologicamente rilevante, allineato per un profiling dettagliato delle cellule immunitarie nei topi neonatali.