Valutazione della dinamica della fissione/fusione mitocondriale nelle cellule tubulari prossimali renali

Nel nostro laboratorio puntiamo a trapiantar mitocondri su organi lesionati per recuperarli. Per questo stiamo sviluppando un nuovo protocollo operativo per isolare mitocondri efficienti e dinamicamente attivi. Le sfide includono il monitoraggio dei mitocondri trapiantati senza colorazione, valutando accuratamente la loro integrazione, funzionalità e comportamento dinamico con le nuove cellule riceventi.

Per iniziare a seminare cellule tubolari prossimali renali in piastre di coltura sul fondo di vetro. Incubare le cellule durante la notte per permetterne l'aderenza e la crescita. Il giorno successivo, aggiungere Cisplatino alla piastra sperimentale fino a una concentrazione finale di due micromolari.

Successivamente, configura i laser di un microscopio confocale a 405 nanometri, 488 nanometri per eccitazione Dendra2 non convertita e 561 nanometri. Accendi i laser e lascia circa 10 minuti di stabilizzazione. Posiziona il disco di coltura nella camera di incubazione.

Aggiungi acqua intorno alla camera e imposta la temperatura a 37 gradi Celsius, assicurando che l'approvvigionamento di anidride carbonica sia mantenuto. Lascia che la camera di incubazione si equilibri prima dell'immagini. Visualizza le cellule utilizzando un ingrandimento e una risoluzione più elevati per l'imaging mitocondriale.

Apri il menu a tendina nell'angolo in alto a sinistra e seleziona le Opzioni FRAP. Utilizzando il software LAS X, definisci la regione di interesse in cui verrà eseguita la fotosbiancatura. Ora, applica un impulso laser ad alta intensità per sbiancare la regione di interesse impostando i laser FRAP a 405 nanometri a 4,00, 488 nanometri a 0,00.

E 561 nanometri a 0,00. Imposta il pre-decandescente a 5,140 secondi per 59 iterazioni e definisci il tempismo post-candeggina. Per l'imaging post-candeggina, si continui ad acquisire immagini a bassa intensità laser per 10 minuti usando laser FRAP a 405 nanometri a 0,00, 488 nanometri a 0,50.

E 561 nanometri a 0,50. Per profilare i mitocondri verdi e rossi fusi, installa prima il plug-in RGB Prolaser. Apri il software ImageJ, poi dal menu File trova e apri il file immagine per analizzarlo.

Seleziona la modalità colore Composite, seleziona l'opzione Autoscala e apri la pila video o immagini per analizzare. Disegna un'area rettangolare sopra l'immagine e clicca con il tasto destro per selezionare Duplica. Seleziona l'opzione Duplicata iperstack per duplicare tutte le pile di immagini.

Seleziona l'immagine e scegli RGB nel menu a tendina Immagine per convertire lo stack duplicato in formato RGB. Duplica l'immagine RGB e seleziona solo un fotogramma. Se i mitocondri appaiono curvi, traccia una linea lungo la loro lunghezza, poi vai nel menu modifica, scegli Selezione e clicca su Raddrizza.

Ora, scegli un titolo per l'immagine raddrizzata e imposta la larghezza della linea a 20 pixel. Traccia una linea lungo il mitocondrio raddrizzato per allinearlo correttamente. E apri il plug-in RGB Prolaser.

Una volta attivato, il plug-in genererà un grafico che mostra le intensità di fluorescenza rossa e verde lungo la linea tracciata. L'altezza di ogni picco sarà direttamente proporzionale all'intensità di fluorescenza. Dopo la fusione, confermare che la fluorescenza rossa si sia diffusa nel mitocondrio verde adiacente, indicando la miscelazione del contenuto.

Verifica che il grafico di intensità ora mostri picchi rossi e verdi sovrapposti. Per valutare la fusione, si selezionano mitocondri sani e fotodecolorati per la fusione nell'imaging a cellule vive. Monitorare il cambiamento del rapporto di fluorescenza rosso-verde nel tempo per indicare gli eventi di fusione.

Le cellule di controllo hanno mostrato mitocondri allungati con matrice gialla che indica la fusione mitocondriale delle matrici rossa e verde. Le cellule trattate con cisplatino hanno mostrato mitocondri frammentati con una ridotta sovrapposizione di segnali rossi e verdi che suggeriscono una fusione compromessa. Il recupero della fluorescenza nella regione fotosbiancata è diminuito nel tempo nelle cellule di controllo, indicando una fusione mitocondriale attiva.

Le cellule trattate con cisplatino mantenevano un rapporto di fluorescenza quasi stabile, indicando una fusione mitocondriale compromessa. L'espressione di CLRS-1 è stata significativamente ridotta nelle cellule trattate con cisplatino rispetto ai controlli. L'uso dell'espressione cellulare di fluorescenza e dei mitocondri foto-commutabili ci aiuta a monitorare i mitocondri e valutare la loro dinamica nelle cellule riceventi.

La misurazione della morfologia dei mitocondri a cellule vive rivela la salute cellulare in tempo reale, il tagging genico e le proteine foto-commutabili aumentano accuratezza e robustezza. Le ricerche future esploreranno i meccanismi cellulari, sia mitocondrici che citoplasmatici, che coordinano il rimodellamento per modellare i mitocondri tubolari, sferici o circolari.