Strategie comparative per il rilevamento dell'ubiquitinazione nei lisati cellulari di mammiferi utilizzando SMAD2/SMURF2 come modello

L'ubiquitinazione governata dalla cascata enzimatica E uno, E due ed E tre è un regolatore chiave della funzione proteica. La flessibilità strutturale dell'ubiquitina gli permette di formare catene diverse tramite diversi collegamenti di lisina o Met one, con ogni topologia che detta un esito distinto: K 48 per la degradazione, K 63 per la segnalazione e la riparazione e Met una per l'immunità innata. Questo studio delinea e confronta due diversi metodi di lisi cellulare per misurare i livelli di applicazione nelle cellule dei mammiferi utilizzando Smurf due e SMAD due come modello, che aiuteranno i ricercatori a selezionare metodi più appropriati per rilevare il livello di ubiquitinazione delle proteine del substrato.

Mantenere HEK due 93 cellule T in DMEM ad alto livello di glucosio integrato con 10% FBS e 1% PS. Cellule seme in sei piastre di pozzo a 500.000 celle per pozzo. Preparare le miscele di trasfezione per rappresentare il 10% del valore totale della coltura e utilizzare l'ubiquitinazione SMAD due come modello sperimentale. Combina diversi plasmidi in 100 microlitri di DMEM senza siero.

In un tubo separato, diluire il reagente di trasfezione. Mentre la miscela di reagenti si inserisce goccia alla soluzione plasmide, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente e distribuire uniformemente sulle cellule. Sostituire il mezzo di trasfezione dopo sei o ore con due microlitri di DMEM fresco e completo per pozzo.

Trattare le cellule con MG di cinque nanometri uno tre due per 12 ore prima del prelievo. Aspira il mezzo e lava ogni pozzo con un millimetro di PBS preraffreddato. Rimuovere completamente PBS.

Trasferisci la sospensione su un tubo da un virgola cinque e mettila sul ghiaccio. Centrifugare a trecentot80 XG per cinque minuti a quattro gradi. Rimuovi il soprandanante e conserva il pellet.

Trasferire 50 microlitri di sfere di agarosio AG proteico per campione in un nuovo tube. Lava le perline tre volte con un millimetro di tampone per la lisi. Rimuovere il buffer residuo senza disturbare il pellet.

A 100 microlitri di soluzione funzionante e cinque microlitri di anticorpi. Aggiungi 500 microlitri di soluzione lavorativa preraffreddata al pellet. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti.

Sonicare a due W usando quattro secondi di on, quattro sec off per cinque ripetizioni. Restituire i campioni al ghiaccio per il resto dell'incubazione. Aggiungi 40 microlitri di soluzione lavorativa al pellet.

Aggiungi cinque microlitri sopra il 10% SDS mentre si mescola continuamente. Vortice brevemente e riscaldato a 95 gradi finché la sospensione non diventa trasparente e completamente liquefatta. Inverti a intermittenza per garantire una denaturazione uniforme.

Aggiungi una soluzione lavorativa da 450 microlitri. Sonicare a due W usando quattro secondi su quattro secondi di pausa per cinque ripetizioni. La centrifuga lisa per 15 minuti a quattro gradi.

Riserva 60 microlitri di lisato e aggiungi 15 microlitri di cinque tamponi multicarico. Riscalda a 95 gradi per 15 minuti e etichetta come input. Aggiungi 100 microlitri di sfere accoppiate ad anticorpi al lisato rimanente.

Incubare a quattro gradi per otto-dodici ore con rotazione. La centrifuga si affianca a 100 XG per un minuto a quattro gradi e si scarta il soprantantante. Aggiungi 75 microlitri di un buffer di carico multi-SDS e colpisci a 95 gradi per 15 minuti per eludere proteine, etichettate come IP. Rilevare proteine ubiquinate tramite western blot.

Le cellule T HE K due 93 sono state trasfettate e stimolate con MG 1 32. Le cellule sono state suddivise in cinque gruppi secondo diversi metodi di trattamento e le differenze tra ciascun gruppo sono le seguenti: senza flag SMAD due corsie uno, senza MG uno tre due corsie due, senza anticorpi FLAG aggiunti nelle perle corsia tre, con MYC-SMURF due corsie cinque. Tutte le celle erano lisate utilizzando il metodo del bagno di ghiaccio.

La corsia uno fungeva da controllo per verificare la superespressione riuscita del plasmide SMAD due. La corsia due ha servito come controllo per dimostrare l'effetto inibitorio di MG uno tre due sulla degradazione delle proteine ubiquitinate. La corsia tre fungeva da controllo per confermare che il legame non specifico fosse stato completamente eliminato.

La corsia cinque è stata utilizzata per indagare l'effetto promozionale di SMURF due sull'ubiquitinazione di SMAD due. Il valore in scala di grigi di HA nella corsia cinque era superiore a quello della corsia quattro, il che dimostrava che il SMURF due aumentava il livello di ubiquitinazione del SMAD due. Quando abbiamo fatto le lysecell utilizzando il metodo del trattamento termico abbiamo ottenuto risultati simili a quelli del metodo del bagno di ghiaccio, tuttavia, utilizzando il metodo del trattamento termico, l'espressione di SMURF due non è stata rilevata nei risultati IP FLAG.

Abbiamo inoltre dimostrato che il metodo di trattamento termico è adatto per la rilevazione dell'ubiquitinazione di proteine endogene. Abbiamo inoltre confrontato l'efficienza dei due metodi nel rilevare i livelli di ubiquitinazione: sia nei risultati dell'input che del IP flag, abbiamo riscontrato che il valore in scala di grigi dell'AH nel gruppo che utilizza il metodo del trattamento termico era superiore a quello del metodo del bagno di ghiaccio. Per migliorare la rilevazione della segnalazione, abbiamo utilizzato l'iperespressione basata su plasmidi combinata con il trattamento MG 13-2 durante il prelievo cellulare per prevenire la degradazione delle proteine ubiquitinate.

La preparazione del lisato richiede un'attenta modulazione della concentrazione di na-cl, poiché un alto salare interrompe l'interazione debole, mentre un basso livello di sale aumenta l'aggregazione aspecifica. Tuttavia, basse concentrazioni possono portare a un eccessivo fondo di fondo da aggregati non specifici. Per un arricchimento proteico migliorato, gli anticorpi contro le sfere a quattro gradi garantiscono una cattura più efficiente delle proteine bersaglio e riducono il legame aspecifico.

Nel trattamento termico, è fondamentale assicurarsi che la concentrazione di SDS rimanga inferiore all'uno per cento; l'SDS di accesso può rimuovere gli anticorpi dalle sfere. Questo studio delinea e confronta diversi metodi di lisi per misurare i livelli di ubiquitinazione nelle cellule di mammiferi utilizzando SMURF due SMAD due come modello che aiuterà i ricercatori a selezionare metodi più appropriati per rilevare i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato.