Ingegneria epigenetica delle cellule K562: strategia episomiale a doppio vettore per la metilazione mirata stabile del DNA utilizzando le proteine di fusione dCas9-DNMT3A e -HDAC1

La nostra ricerca mira a sviluppare un sistema stabile e non integrato per la metilazione mirata del DNA, esplorando l'editing epigenetico duraturo nelle cellule K562. I progressi recenti nel campo includono sistemi CRISPR-dCas9 a doppio effettore, che combinano enzimi epigenetici per modifiche epigenetiche sinergiche, stabili e specifiche per località. Per cominciare, mantenere le cellule K562 in fiaschette di coltura T75 a 37 gradi Celsius con condizioni di anidride carbonica al 5% e umidificate.

Quantificare il DNA episomale da utilizzare per la trasfezione utilizzando uno spettrofotometro a 260 nanometri. Utilizzare otto microgrammi di DNA plasmidico totale per ogni trasfezione preparando quattro microgrammi di ciascun plasmide per una co-trasfezione, e mescolare la quantità richiesta con 90 microlitri di acqua ultrapura. Ora, aggiungi 10 microlitri di soluzione di acetato di sodio a 3 molari e 2,5 volumi di etanolo al 100% alla soluzione di DNA diluita.

Mescola accuratamente la soluzione di DNA e incubala tutta la notte a 20 gradi Celsius per permettere la precipitazione del DNA. Il giorno seguente, centrifugare il tubo di precipitazione del DNA a 11.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. In condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza, scartare con cura il soprantantante dal tubo.

Aggiungi 500 microlitri di etanolo al 70% nel tubo per lavare il pellet, e centrifuga di nuovo a 11.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere completamente il sovrantato etanolico dal tubo e lasciare asciugare la pellet all'aria finché non rimane etanolo visibile. Poi, risospendere accuratamente il pellet di DNA essiccato in 50 microlitri di DMEM.

Conserva 400 nanogrammi del DNA risospeso circa 2,5 microlitri in un nuovo tubo e conserva la soluzione plasmide DMEM a quattro gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Analizza il campione di DNA rimanente su un gel all'1%agarosio per verificare la purificazione e l'integrità del DNA. Preleva le cellule di K562 da una fiaschetta T75 quando le colture raggiungono una confluenza del 50-60% per garantire un'efficienza ottimale di trasfezione.

Contare le cellule prelevate utilizzando un emocitometro e trasferire un volume che contiene due volte 10 alla potenza di cinque cellule in una ciotola da 35 millimetri contenente 900 microlitri di DMEM senza FBS né antibiotici. Posizionare la teglia di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per mantenere le cellule pronte alla trasfezione. Utilizza un kit di trasfezione a base di lipofettamine per somministrare plasmidi seguendo le istruzioni del produttore e regolando i volumi se necessario.

Aggiungi tre microlitri di reagente P3000 alla soluzione plasmidica DMEM preparata in precedenza. Mescola delicatamente e incuba il composto a temperatura ambiente per cinque minuti. Ora, aggiungi cinque microlitri di reagente Lipofectamina 3000 insieme a abbastanza DMEM per raggiungere un volume finale di 100 microlitri.

Incuba questo mix di trasfezione a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungi i 100 microlitri completi della miscela di trasfezione al piatto da 35 millimetri contenente le cellule. Scuoti delicatamente il piatto per distribuire uniformemente la miscela, poi rimettilo nell'incubatrice.

A 24 ore dalla trasfezione, aggiungere tre millilitri di DMEM intero integrato con FBS al 10% e una volta di streptomicina di penicillina a ciascun piatto per favorire la proliferazione delle cellule trasfectate. A 72 ore dalla trasfezione, iniziare la selezione aggiungendo l'antibiotico G418 per raggiungere una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Una volta stabilito il processo di selezione e il numero totale di cellule superato uno per 10 alla potenza di sei, prelevare le celle tramite centrifugazione a 300 G per sei minuti a 25 gradi Celsius.

Lava il pellet una volta con PBS sterile una volta, pH circa 7,4, e centrifuga di nuovo nelle stesse condizioni. Dopo aver risospeso il pellet cellulare finale in PBS una volta, determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione a uno per 10 alla potenza di sei celle per millilitro, assicurandosi che le cellule siano completamente risospese, e trasferire le cellule in un tubo di citometria a flusso.

Successivamente, impostare il selezionatore di cellule attivato a fluorescenza in modalità singola utilizzando una piastra trattata con coltura tissutale a 96 pozzi come dispositivo di raccolta. Regola le impostazioni del software in base allo strumento utilizzato. Bloccare la popolazione primaria selezionando le celle basandosi sulla diffusione diretta e laterale per isolare la dimensione e la granularità attese.

Escludere detriti e cellule molto granulari o morte, e utilizzare grafici di scatter forward area rispetto all'altezza o laterali rispetto all'altezza per portare i singolini. Poi, riempire ciascun pozzo della piastra a 96 pozzi con 100 microlitri di mezzo pieno contenente un milligrammo per millilitro di G418, e riscaldare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius. Esegui il classamento delle celle in modalità singola, mantenendo la frequenza di ordinamento sotto i 300 eventi al secondo per migliorare la precisione.

Dopo lo smistamento, ispezionare ogni pozzo al microscopio per confermare la presenza di una singola cella per pozzo e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Permettere ai cloni a singola cellula di espandersi individualmente nella piastra a 96 pozzi. Una volta che la crescita clonale è evidente, si aggiunge un mezzo contenente G418 ridotto ai pozzi fino a una concentrazione finale di 400 microgrammi per millilitro per mantenere la pressione di selettiva.

Trasferire i cloni in crescita in forma sequenziale su piastre a 12 pozzi, poi su fiaschette T25 e infine su fiaschette T75 secondo necessità, finché ogni clone raggiunge circa uno per 10 alla potenza di sei celle. Successivamente, raccogli pellet a doppia cella a intervalli regolari. Conserva un pellet a meno 20 gradi Celsius per l'estrazione del DNA genomico.

Omogeneizzare un secondo pellet in 500 microlitri di reagente TRIzol e conservarlo a meno 20 gradi Celsius per l'estrazione dell'RNA e la sintesi complementare del DNA. Estrarre DNA genomico da cloni selezionati utilizzando estrazione di fenolo-cloroformio seguita da precipitazione con etanolo. Risospensa completamente il DNA estratto in acqua priva di nucleasi o in un tampone TE.

Misurare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando uno spettrofotometro prima di proseguire verso le fasi a valle. Infine, estrai l'RNA totale dalle capsule cellulari immagazzinate usando il reagente TRIzol, seguito dalla precipitazione con isopropanolo. Le singole cellule sono state selezionate in piastre da 96 pozzi utilizzando l'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza per isolare quelle che trasportano entrambi i costrutti.

L'analisi PCR di 10 cloni espansi ha confermato che solo alcuni hanno mantenuto entrambi i costrutti, indicati da bande a 230 coppie di basi e 205 coppie di basi. La pirosequenziazione ha rivelato che il clone due positivo mostrava una metilazione aumentata in più siti CPG vicino alla regione target gRNA1 rispetto al controllo non trasfettato. Affrontiamo la mancanza di sistemi di somministrazione a lungo termine non integrati, consentendo un editing epigenetico preciso e stabile senza alterare il genoma ospite.

I nostri risultati stabiliscono uno strumento affidabile per studiare la regolazione genica tramite metilazione bersaglio e supportano lo sviluppo di possibili terapie epigenetiche precise. Le ricerche future esploreranno il miglioramento della somministrazione episomale, la minimizzazione degli effetti bersaglio, il potenziamento dell'efficienza di Cas9 e l'adattamento del sistema per modelli primari o in vivo.