Name: Generazione efficiente e rapida di cellule killer indotte da CAR-T e citochine in dispositivi scalabili GMP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Impara un protocollo G-Rex scalabile per espandere cellule CAR-T e CIK con alta densità e minimo intervento utente. Questo metodo garantisce elevata vitalità cellulare e funzionalità citotossica per applicazioni cliniche.

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<ol><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
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<li>Palmerini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-free+protocol+for+the+ex+vivo+expansion+of+cytokine-induced+killer+cells+using+gas-permeable+static+culture+flasks%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks.</a> Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).</li>
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<li>Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+cytokine-induced+killer+cell+activity+by+CD16+engagement+with+clinical-grade+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies.</a> OncoImmunology. 5, e1199311(2016).</li>
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<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
<li>Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+process+development+of+NK+and+CAR-NK+expansion+in+a+closed+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor.</a> Front Immunol. 15, 1412378(2024).</li>
<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
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La terapia cellulare adottiva (ACT) è diventata un pilastro importante delle terapie avanzate per il trattamento del cancro. Questo approccio si basa sulla somministrazione di prodotti cellulari ampliati ex vivo per ottenere un'efficaciaantitumorale 1. Ad oggi, molti tipi cellulari sono stati utilizzati nell'ACT, che vanno da approcci antispecifici antigenici, ad esempio natural killer (NK)2, cytochine-doted killer (CIK)3,4, natural killer T (NKT)5 o cellule Tγδ 6, fino a cellule altamente specifiche e personalizzate, come i linfociti infiltranti tumorali (TIL)7 e terapie cellulari ingegnerizzate, ad esempio il recettore antigenico chimerico (CAR)1. 8 e cellule recettori delle cellule T (TCR) 9,10.
Le cellule CAR-T sono cellule T geneticamente modificate generate da trasduzione virale ex vivo per esprimere un recettore immunitario sintetico progettato per riconoscere un bersaglio molecolare specifico. La struttura CAR consiste in un anticorpo Fragment a catena singola (scFv) specifico per antigene, combinato con domini di segnalazione intracellulari, inclusa la catena TCRζ e molecole costimolanti. All'attivazione dell'antigene, il dominio intracellulare fornisce segnali di attivazione che promuovono la proliferazione delle cellule T e l'attivitàantitumorale 11.
Le cellule CIK sono una popolazione eterogenea di linfociti T attivati che acquisiscono l'espressione del CD56 durante l'espansione ex vivo dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) o dal sangue del cordone ombelicale (UCB)12. Questa espansione prevede la stimolazione con Interferone-γ (IFN-γ), anticorpi monoclonali anti-CD3 e Interleucina-2 (IL-2), seguita da una coltura in IL-2 per 14 giorni. Le cellule CIK somigliano funzionalmente sia alle cellule NK che a quelle T, esercitando attività antitumorale sia attraverso meccanismi indipendenti dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sia tramite meccanismi dipendenti 13,14,15,16. Queste proprietà permettono alle cellule CIK di essere utilizzate sia in contesti terapeutici allogenici che autologhi con un rischio minimo di malattia innesto contro ospite (GvHD) 17.
Nella pratica clinica, sia le terapie cellulari CAR-T che CIK richiedono la somministrazione di un gran numero di cellule. Le cellule CAR-T vengono infuse a 50-200 milioni di dosi per ognipaziente 18. Analogamente, le cellule CIK vengono tipicamente somministrate a dosi fino a 10 miliardi di cellule per infusione, con i pazienti che spesso ricevono più infusioni a seconda del protocolloterapeutico 19. I metodi tradizionali di coltura cellulare che utilizzano fiaschette o piastre sono inefficienti, richiedono tempo e richiedono un passaggio frequente, rendendo l'espansione su larga scala irrealizzabile e aumentando il rischio di contaminazione. Sistemi automatizzati o semi-automatizzati che utilizzano colture a sacchi o bioreattori permettono un'espansione su larga scala ma presentano limitazioni, cioè lo stress di taglio o la necessità di aggiustamenti di densità e la frequente perfusione del mezzo20,21, e la gestione di un lotto alla volta, portando a costi elevati sia in contesto accademico che industriale. In questa situazione difficile, un'alternativa è rappresentata dal dispositivo di espansione rapida permeabile al gas (G-Rex), un metodo di coltura statica dotato di una membrana di silicio sul fondo del pozzo, che garantisce uno scambio efficiente di ossigeno e un'altezza maggiore dei recipienti, consentendo una capacità di mezzo ad alto volume. Pertanto, il sistema supporta la crescita cellulare senza sostituzione del mezzo o aggiustamento delladensità 22,23. I sistemi G-Rex-M hanno dimostrato scalabilità fino a 5000 mL e sono compatibili con sistemi automatizzati di raccolta, fornendo una piattaforma di coltura chiusa e priva di contaminazioni, facilmente trasferibile da contesti accademici a clinici per lo sviluppo di prodotti medicinali di terapia avanzata (ATMP)24.
Nella procedura descritta, abbiamo sfruttato i vantaggi e le caratteristiche dei dispositivi G-Rex per ottimizzare il protocollo di espansione sia delle celle CAR-T che CIK. Abbiamo dimostrato che entrambi i tipi cellulari possono essere espansi e scalati in modo efficiente, mantenendo un fenotipo e un profilo funzionale coerenti tra diversi sistemi di coltura. Una panoramica schematica del protocollo di espansione sia per le celle CIK che per quelle CAR-T è mostrata nella Figura 1.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Panoramica dei protocolli di espansione delle celle CAR-T e CIK utilizzando dispositivi di coltura G-24 o G-6M. Le cellule CAR-T e CIK vengono espanse da PBMC isolate a partire dal Giorno 0. Per l'espansione delle cellule CAR-T, i PBMC vengono stimolati al giorno 1 con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, modificati geneticamente al giorno 2, e successivamente coltivati con integrazione di hIL-7 e hIL-15 ogni 3-4 giorni, con il prelievo finale per i test funzionali al giorno 9. Nel formato G-6M, l'integrazione di citochine è limitata al secondo giorno, senza bisogno di alimentazione aggiuntiva con citochine durante il periodo di coltura. Per l'espansione delle cellule CIK, i PBMC vengono stimolati al giorno 1 con rhIFN-γ e al giorno 2 con anticorpi anti-CD3 e rhIL-2, che vengono poi somministrati ogni 3-4 giorni. Nel G-24, è necessario un cambiamento del mezzo contemporaneamente all'integratore di citochine. Le cellule CIK vengono prelevate al giorno 14 per i test funzionali a valle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Brillante Buffer di Tinta</td><td>BD in Biologia</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD28, anti-umano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-375</td><td>Clone 15E8</td></tr><tr><td>Anticorpo CD3, anti-umano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-387</td><td>Clona OKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD in Biologia</td><td>740147</td><td>Clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>Biolegend</td><td>320808</td><td>Clone 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD in Biologia</td><td>563875</td><td>Clone SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD in Biologia</td><td>563429</td><td>Clone HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>Biolegend</td><td>318306</td><td>Clone HCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD in Biologia</td><td>555543</td><td>Clone FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD in Biologia</td><td>562428</td><td>Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Kit di proliferazione delle cellule violette CellTrace</td><td>ThermoFisher scientifico</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolossido (DMSO)</td><td>ThermoFisher scientifico</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco & prime; s Soluzione salina tamponata con fosfato (D-PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>E-plate 16</td><td>Agilent</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino (FBS), Valore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Stain di Vitalità Riparabile 780 (FVS780)</td><td>BD in Biologia</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Piastra G-Rex a 24 Pozzi &nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>Piastra del pozzo G-Rex 6M &nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione buffer HEPES</td><td>Lonza</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>Il suo anticorpo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>Albumina umana 20%</td><td>CSL Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante IL-15 umana</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante IL-7 umana</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD in Biologia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Tecnologie STEMCELL</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Linea cellulare del cancro al seno &nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina e Streptomicina</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione fisiologica (0,9% Cloruro di sodio)</td><td>Monico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di protamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Linea cellulare del linfoma di Burkitt &nbsp;</td></tr><tr><td>IFN-gamma umana ricombinante</td><td>R& Sistemi D</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 ricombinante (Proleucina)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-Lui</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>Istituto Memoriale Roswell Park 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina stabile</td><td>Lonza</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Trypan-Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Analisi delle celle in tempo reale xCELLigence</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Cellulare Ematopoietico Privo di Siero X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione efficiente e rapida di cellule killer indotte da car-t e citochine in dispositivi scalabili gmp

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

Il protocollo descritto qui fornisce un flusso di lavoro efficiente e robusto per l'espansione e l'ingegnerizzazione ex vivo delle celle effettrici da PBMC isolate, ovvero celle CAR-T e CIK. Questo metodo richiede una manipolazione cellulare minima e sfrutta la capacità di scambio gassoso dei dispositivi G-Rex, offrendo una migliore disponibilità di nutrienti e ossigenazione rispetto ai sistemi di coltura staticaconvenzionali 23,24. Un vantaggio chiave di questo protocollo è la sua scalabilità intrinseca da dispositivi su piccola scala a 24 pozzi (G-24), adatti per studi preclinici, a dispositivi più grandi da 6M (G-6M), compatibili con esigenze di produzione traslazionale o cliniche, senza richiedere modifiche al protocollo se non la scalabilità proporzionale.
Utilizzando questo protocollo, sia le cellule CAR-T che CIK sono state espanse con successo in parallelo da PBMC di donatore sano nei formati G-24 e G-6M, come descritto nelle Sezioni 2-4. Al termine del periodo di coltura, entrambi i tipi cellulari mostravano un'elevata espansione e vitalità di ripiegamenti, con una proliferazione comparabile tra i due formati di dispositivi (Figura 2, Tabella Supplementare 1, Tabella Supplementare 2), evidenziando la riproducibilità del protocollo su diverse scale di coltura.
Per validare la scalabilità dei dispositivi di coltura, le cellule effettrici sono state ulteriormente caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente. Per le cellule CAR-T CD19, abbiamo quantificato l'espressione di CAR e valutato i sottoinsiemi CD4+ e CD8+, osservando una predominanza di cellule T CD19 CD8+ (Figura 3A-B, Tabella Supplementare 1). Per le cellule CIK, abbiamo valutato la frequenza delle popolazioni T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) e CIK (CD3+CD56+) (Figura 3D), così come l'espressione del recettore attivante NKG2D (Figura 3E, Tabella supplementare 2). Inoltre, abbiamo osservato fenotipi e espressioni complessivamente comparabili di specifici marcatori di popolazione tra i formati di coltura G-24 e G-6M sia per le cellule CAR-T che per quelle CIK. Lo stato di differenziazione sia dei prodotti cellulari CAR-T che CIK CD19 è stato analizzato tramite colorazione CD62L e CD45RA (Figura 3C-F, Tabella Supplementare 1, Tabella Supplementare 2), rivelando fenotipi simili di memoria ed effettori tra cellule coltivate nei formati G-24 e G-6M. Questi risultati dimostrano che l'espansione del processo non compromette l'integrità fenotipica o lo stato di differenziazione delle popolazioni cellulari effettrici ampliate.
Infine, per valutare la potenza funzionale, abbiamo utilizzato saghi di citotossicità specifica per target. Sia le cellule CD19 CAR-T che CIK espanse in entrambi i dispositivi hanno mostrato una potente attività citolitica, confermando il mantenimento delle proprietà funzionali su scala (Figura 4). Nel complesso, questi risultati supportano l'idoneità dei prodotti ampliati per applicazioni a valle nei modelli preclinici e potenzialmente nei test clinici.
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Proliferazione e vitalità delle cellule CAR-T e CIK CD19. Le cellule CAR-T (n = 5) e CIK (n = 6) espanse da PBMC nelle placche G-24 e G-6M sono state raccolte rispettivamente al giorno 9 e al giorno 14 di espansione per effettuare il conteggio cellulare e la valutazione dell'aumento del pieghe (A-C) e della percentuale (B-D) delle cellule vitali. Gli istogrammi rappresentano l'espressione media ± deviazione standard (SD), e i punti indicano i singoli donatori (vedi Tabella Supplementare 1 e Tabella Supplementare 2 per i valori individuali). I dati sono stati analizzati tramite il test t a doppia coda (A-C) o il test di rango a coppie abbinate multiple a due code Wilcoxon (B-D), con correzione di Holm-Sidak per confronti multipli (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: La valutazione del fenotipo delle cellule CD19 CAR-T e CIK si è ampliata nei dispositivi G-24 e G-6M. L'espressione delle molecole CAR sulle cellule CAR-T CD19 (n = 5) è stata analizzata tramite citometria di flusso per valutare (A) l'efficienza di trasduzione nei protocolli di espansione G-24 e G-6M, nonché l'espressione delle sottopopolazioni (B) CD4+/CD8+ e (C) naive/memory nel sottoinsieme CD3+CAR+. Il fenotipo delle cellule CIK di massa (n = 6) è stato analizzato tramite citometria a flusso per indagare (D) la percentuale di CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) e T (CD3+CD56-), nonché l'espressione di (E) NKG2D e (F) la sottopopolazione ingenua/memoria nel sottoinsieme CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). Naïve (CD45RA+CD62L+), memoria centrale (CM, CD45RA-CD62L+), memoria effettore (EM, CD45RA-CD62L-) e memoria effettore CD45RA-positivo (EMRA, CD45RA+CD62L-). Gli istogrammi rappresentano l'espressione media ± SD, e i punti indicano donatori singoli (vedi Tabella Supplementare 1 e Tabella Supplementare 2 per valori individuali). I dati sono stati analizzati tramite il test t a doppia coda (B-C-D-F) o il test di rango abbinato di Wilcoxon a due code (A-E), con correzione di Holm-Sidak per confronti multipli (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Valutazione della citotossicità delle cellule CAR-T e CIK CD19. (A) La lisi specifica delle cellule CAR-T CD19 (arancioni, n = 5) o delle cellule non trasdotte (UTD) (grigie, n = 5) contro la linea cellulare Raji del linfoma di Burkitt (come modello di linea cellulare a sospensione) è stata eseguita tramite un saggio di uccisione basato su citometria a flusso di 6 ore. I risultati sono mostrati come la lisi specifica media ± SD. (B) La citotossicità delle cellule CIK coltivate in G-24 (azzurro chiaro, n = 7) o G-6M (blu scuro, n=6) contro la linea cellulare MCF-7 del cancro al seno (come modello di linea cellulare aderente) è stata monitorata ogni 15 minuti per 24 ore utilizzando un analizzatore cellulare in tempo reale. I risultati sono mostrati come la lisi specifica media ± SEM. I dati sono stati analizzati tramite test di Mann-Whitney, correzione di Holm-Sidak per confronti multipli (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Strategia di gating utilizzata per le analisi della citometria a flusso. Grafici rappresentativi che illustrano le strategie di gating per (A) la caratterizzazione fenotipica delle cellule CAR-T e (B) la caratterizzazione fenotipica delle cellule CIK, e (C) il saggio di citotossicità basato su coloranti fluorescenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo File.</a>
Tabella supplementare 1: Crescita, vitalità e fenotipo delle colture di cellule CAR-T CD19 da donatori individuali. Per ciascun donatore vengono mostrati il numero totale di cellule, l'aumento della piega, la vitalità e la caratterizzazione fenotipica delle cellule T CD19-CAR prelevate al giorno 9 di coltura in dispositivi G-24 e G-6M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo File.</a>
Tabella supplementare 2: Crescita, vitalità e fenotipo delle colture cellulari CIK da singoli donatori. Il numero totale di cellule, l'aumento del piegamenti, la vitalità e la caratterizzazione fenotipica delle cellule CIK prelevate al giorno 14 di coltura in dispositivi G-24 e G-6M sono mostrati per ciascun donatore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo File.</a>

Generazione efficiente e rapida di cellule killer indotte da CAR-T e citochine in dispositivi scalabili GMP

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Impara un protocollo G-Rex scalabile per espandere cellule CAR-T e CIK con alta densità e minimo intervento utente. Questo metodo garantisce elevata vitalità cellulare e funzionalità citotossica per applicazioni cliniche.

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