Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dell'acetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi

Comprendere il traffico dei recettori dell'acetilcolina nicotinica verso le membrane plasmatiche dei mammiferi è fondamentale per indagare la regolazione mediata dai chaperoni e valutare terapie selettive per il bersaglio. Un vantaggio principale delle sonde sensibili al pH combinate con la microscopia confocale a cellule vive è l'elevata risoluzione spaziale della localizzazione delle subunità. Per cominciare, preriscaldare i reagenti a 37 gradi Celsius.

Scongela completamente la subunità DNasi di nAChR e porta il reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Pulisci tutti i reagenti con etanolo al 70% prima di metterli all'interno dell'armadietto di biosicurezza. Per esprimere le nAChR alfa-7, in un tubo microcentrifuga, diluire la DNasi plasmide alfa-7 e NACHO in un mezzo sirico ridotto.

Mescola delicatamente pipettando dopo l'aggiunta del DNA. In alternativa, per esprimere i recettori alfa-4 beta-2, diluire 4 microgrammi di ogni DNA subunitario in un totale di 250 microlitri di mezzo siero ridotto e mescolare delicatamente. Regolare i rapporti delle subunità per ottimizzare l'espressione di isoforme specifiche dei recettori.

Per i recettori alfa-4 beta-2 con un plasmide aggiuntivo, aggiungere quantità uguali di ciascun DNA plasmidiale. Successivamente, in un nuovo tubo microcentrifuga, diluire 8 microlitri di reagente di trasfezione goccia a goccia in 250 microlitri di mezzo siero ridotto. Dopo un'incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente, si combina la DNasi diluita con il reagente di trasfezione diluito goccia a goccia in un tubo.

Mescola delicatamente pipettando e incuba per 20 minuti a temperatura ambiente. Mentre si formano complessi, sostituisci il mezzo nei piatti di coltura con 1 millilitro di EMEM senza siero. Aggiungi 500 microlitri del complesso del reagente di trasfezione del DNA goccia a goccia in ogni piatto.

Mescola delicatamente dondolando il piatto per distribuirlo uniformemente, specialmente sulla superficie inferiore del vetro. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore e sostituire il substrato dopo 4-6 ore. Rimuovi il vecchio mezzo tramite aspirazione.

Sciacquare il piatto tre volte con due millilitri di PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Poi aggiungi 2 millilitri di tampone per immagini pH 7,4 all'antenna. Inserire il piatto di imaging nel portavetri di un microscopio confocale e posizionare il portaoggetti nella camera ambientale preriscaldata.

Collega il tubo della pompa peristaltica al supporto per piatti per immagini e chiudi la camera ambientale. Ora, avvia il software di imaging e seleziona i laser per i fluorofori di interesse. Scansiona la parabola per localizzare le cellule da immagino usando un obiettivo 10-60 x.

Aumenta l'ingrandimento se desideri e regola la profondità di messa a fuoco se necessario. Seleziona la risoluzione preferita e cattura una singola immagine usando l'obiettivo desiderato. Registra la posizione sulla mappa dell'antenna per spostare le stesse celle dopo il cambio del buffer.

Ripeti l'imaging per diverse aree della parabola usando le stesse impostazioni di cattura per tutte le immagini. Mantenendo solo la linea di uscita collegata alla pompa peristaltica, aspira lentamente il tampone pH 7.4 dalla piattaforma in un contenitore di rifiuti. Poi trasferisci la linea di ingresso al tampone di tempra a pH 5,5.

Accendi la pompa peristaltica per aggiungere un tampone di pH 5,5 a una portata di 1,5 millilitri al minuto, assicurandoti che le celle rimangano attaccate. Dopo 20 minuti, spegni la pompa e incuba le cellule nel buffer per altri 20 minuti per permettere l'equilibrio. Dopo l'incubazione, ripetere l'imaging delle località salvate.

Per iniziare la quantificazione dell'immagine, apri ImageJ e carica l'immagine da analizzare. L'immagine apparirà come una pila con ogni canale catturato visualizzato nello stesso fotogramma. Naviga sul canale di fase.

Se l'immagine appare troppo luminosa, seleziona Processa e scegli Aumenta contrasto, poi clicca su OK. Usa lo strumento della lente d'ingrandimento per zoomare su una cella. Usa lo strumento di selezione a mano libera per tracciare il contorno della cella nel canale di fase. Poi passa al canale fluorescente corrispondente al fluoroforo di interesse.

Imposta le misurazioni desiderate selezionando Analizza e cliccando su Imposta Misurazioni. Assicurati che vengano controllati Area, Valore grigio medio e densità integrata. Per misurare la regione selezionata, scegli Analizza e poi clicca su Misura.

Effettua tre misurazioni di fondo tracciando aree vuote vicino alla cella selezionata. Dopo aver effettuato le misurazioni per tutte le celle desiderate, copia e incolla i dati di misurazione in Excel per l'analisi. Poi calcola la media di fondo media dalle tre misure di fondo.

Calcola il valore corretta della fluorescenza totale della cella o CTCF per ciascuna cellula utilizzando la formula fornita. Utilizzando lo stesso flusso di lavoro, analizza le immagini acquisite dopo il cambio del buffer. Esporta tutti i risultati in software di analisi dati per l'elaborazione statistica.

Una debole colorazione con alpha-BTX AF647 è stata osservata nelle cellule N2a non trasfettite, mentre una marcatura robusta dei puntati è stata rilevata in cellule trasfettate con alpha-7 DNA. La quantificazione ha confermato che l'espressione plasmatica di nAChR alfa-7 nella membrana era significativamente più alta nelle cellule N2a trasfettate con alfa-7 rispetto ai controlli non trasfecti. Al pH 7,4, la fluorescenza totale di alpha-7 pHuji era visibile alla membrana plasmatica.

nelle cellule N2a trasfectate. Al pH 5,5, la fluorescenza alpha-7 pHuji è stata ridotta, rivelando la localizzazione interna dei recettori. La fluorescenza esterna del recettore alpha-7 pHuji spiegava la maggior parte dell'espressione dei recettori.

La quantificazione ha mostrato che l'82,6% dei recettori alpha-7 pHuji era situato sulla membrana plasmatica, mentre il 17,4% era interno. La fluorescenza è stata ripristinata al ritorno al pH 7,4, confermando la reversibilità del segnale pHuji. Al pH 7,4, le cellule N2a che esprimono alfa-4 SEP e beta-2 pHuji mostrarono una robusta fluorescenza della membrana per entrambe le subunità.

A pH 5,5, la fluorescenza è stata stenuta, indicando la localizzazione interna di alcune subunità alpha-4 SEP e beta-2 pHuji. La quantificazione ha mostrato che il 76,5% della SEP alfa-4 era nella membrana plasmatica e il 23,4% era interno. Nelle cellule triplicemente trasfettate, l'alfa-4 SEP ha mostrato l'82,8% di localizzazione della membrana e il 17,2% di espressione interna.

Nelle stesse cellule, il 63,4% delle subunità beta-2 pHuji era localizzato sulla membrana, mentre il 36,6% era localizzato intracellularmente. Utilizzando il protocollo presentato, abbiamo caratterizzato nuovi effetti del chaperone sull'espressione e il traffico dei recettori nicotinici, e abbiamo valutato nuove terapie selettive per bersagli. Un vantaggio del nostro protocollo è l'adattabilità per recettori nicotinici omomerici ed eteromerici, permettendo la quantificazione della posizione cellulare relativa.

Il nostro approccio consente un'espressione rapida e robusta della membrana plasmatica dei recettori nicotinici, facilitando l'analisi del traffico mediato da accompagnatori e gli sforzi di scoperta di farmaci.