Name: Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dellacetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Scopri la localizzazione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina nelle cellule di mammiferi tramite imaging quantitativo con tag fluorescenti pH-sensibili. Questo metodo consente di distinguere l'espressione di membrana da quella intracellulare con alta risoluzione.

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<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Reagente di distacco cellulare</td></tr><tr><td>Alpha-Bungarotoxin Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>B35450</td><td>Coniugato di alfa-bungarotossina</td></tr><tr><td>Cabinet di biosicurezza BSL-livello 1 & nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Area di lavoro per colture cellulari sterili</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9224</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>EMEM con L-glutamina</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Mezzo cellulare</td></tr><tr><td>DNA privo di endotossine</td><td>Realizzato in casa con kit Zymo</td><td>Non applicabile</td><td>DNA nAChR da utilizzare per trasfezioni transitorie cellulari</td></tr><tr><td>Tubi microcentrifughe privi di endotossina, 0,5 mL&nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>89000-010</td><td>DNA e preparazione della trasfezione</td></tr><tr><td>Tubi microcentrifughe privi di endotossine, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>20170-038</td><td>DNA e preparazione della trasfezione</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Aventor/VWR</td><td>97068-085</td><td>Integratore siero</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>Microscopio Confocale</td></tr><tr><td>Piatti MatTek con fondo di vetro</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>Antenni di imaging</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v. 10</td><td>GraphPad Prism</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td>Software di analisi dei dati</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Termoscientifica</td><td>413410025</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Idrato MES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>M5287</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>mTagBFP2-pBAD</td><td>AddGene&nbsp;</td><td>54572</td><td>DNA di controllo da utilizzare per la trasfezione di transitori cellulari &nbsp;</td></tr><tr><td>Cellule Neuro 2 A (N2A)</td><td>Collezione della Cultura di Tipo Americano</td><td>CCL-131</td><td>Cellule utilizzate per trasfezioni di DNA ed espressione di nAChR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Mezzo sirico ridotto</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Aventor/VWR</td><td>K952-100mL</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>Pompa per peristalsi</td><td>Gilson</td><td>MiniPuls3</td><td>Il buffer cambia durante l'imaging &nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Qualità Biologica</td><td>119-069-131</td><td>Buffer fisiologico</td></tr><tr><td>Aiuto a pipette</td><td>Drummond&nbsp;</td><td>140084</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Punte di pipette (sterili e senza endotossine, 1000uL)</td><td>Rainin</td><td>30389216</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Punte per pipette (sterili e prive di endotossine, 20uL)</td><td>Rainin</td><td>30389229</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Punte per pipette (sterili e prive di endotossine, 250uL)</td><td>Rainin</td><td>30389246</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Pipettes, P10</td><td>Rainin & nbsp;</td><td>L-10XLS</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Pipettes, P100</td><td>Rainin & nbsp;</td><td>L-100XLS</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Pipettes, P1000</td><td>Rainin & nbsp;</td><td>L-1000XLS</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Pipete sierologiche (sterili e prive di endotossine, 10 ML)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-898</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Pipete sierologiche (sterili e prive di endotossine, 25 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-900</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Pipete sierologiche (sterili e prive di endotossine, 5 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>76201-710</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Pipete sierologiche (sterili e prive di endotossine, 50 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>75816-088</td><td>Trasferimento preciso del liquido</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9286</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Fiaschetta per coltura tissutale</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>Piatti in coltivazione</td></tr><tr><td>Kit Maxiprep per plasmidi ZymoPure II</td><td>RICERCA SU ZYMO</td><td>D4203-A + D4203-B</td><td>Produzione di DNA privo di endotossine</td></tr><tr><td>&alpha; 4-SET&nbsp;</td><td>Servizi di sintesi genica ThermoFisher Scientific GeneArt &nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Servizi personalizzati di sintesi genica</td></tr><tr><td>&alpha; 7-pHuji</td><td>Twist Bioscience</td><td>https://www.twistbioscience.com/</td><td>Servizi personalizzati di sintesi genica</td></tr><tr><td>&beta; 2-pHuji</td><td>Servizi di sintesi genica ThermoFisher Scientific GeneArt &nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Servizi personalizzati di sintesi genica</td></tr></tbody></table>

localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dell'acetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi

Localization of Plasma Membrane and Intracellular Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors Using Quantitative Imaging in Mammalian Cells

Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dell'acetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi

Quantification of neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) expressed on the plasma membrane of mammalian cells is important for the development ...

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di quantificazione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina cambiamenti all'interno delle regioni subcellulari di sottotipi specifici di neuroni del sistema nervoso centrale per comprendere meglio i meccanismi della dipendenza da nicotina utilizzando una combinazione di approcci tra tagging proteina fluorescente del recettore con il knock-in approccio e spettrale confocale.

Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina

Etichettando i domini extracellulari dei recettori di membrana con pHluorin superecliptic, e da imaging questi recettori di fusione in neuroni di topo in coltura, si può visualizzare direttamente i singoli eventi di inserzione vescicolari dei recettori della membrana plasmatica. Questa tecnica sarà determinante per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l'inserimento recettore alla membrana plasmatica.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

Fonte: Zhang, J., et al. Analisi quantitativa ad alta risoluzione dell'immunooro dei recettori di membrana nelle sinapsi del nastro retinico. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra una tecnica di microscopia elettronica per visualizzare la localizzazione del recettore dei neurotrasmettitori nelle sinapsi retiniche. Le sezioni retiniche contengono cellule gangliari retiniche che esibiscono recettori dei neurotrasmettitori legati alla membrana e sono marcate con la subunità B della tossina del...

Imaging ad alta risoluzione dei recettori dei neurotrasmettitori nelle sinapsi retiniche

In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Abbiamo sviluppato una preparazione gene-chimerica del circuito ventrale ippocampale – accumbens in vitro che consente l'imaging diretto dal vivo per analizzare i meccanismi presinaptici della trasmissione sinaptica mediata dai recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR). Questa preparazione fornisce anche un approccio informativo per studiare i meccanismi pre- e post-sinaptici della plasticità sinaptica.

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Il metodo immunogold post-inclusione è uno dei modi più efficaci per fornire analisi ad alta risoluzione della localizzazione subcellulare di molecole specifiche. Qui descriviamo un protocollo per analizzare quantitativamente i recettori del glutammato nelle sinapsi del nastro retinico.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Le tecniche di microscopia ottica abbinate a saggi biochimici chiariscono il coinvolgimento dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni netrina-dipendente. Questa combinazione di tecniche consente l'identificazione dei meccanismi molecolari che controllano la ramificazione degli assoni e il cambiamento della forma cellulare.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Questo articolo presenta un metodo per lo studio dei recettori nicotinici per l'acetilcolina (nAChR) nelle fette del cervello del mouse di nicotina uncaging. Quando accoppiato con simultanea patch clamp registrazione e microscopia a scansione laser di 2 fotoni, nicotina uncaging collega la funzione del recettore nicotinico con morfologia cellulare, fornendo una più profonda comprensione della neurobiologia colinergico.

Funzione del recettore nicotinico dell'acetilcolina in fettine di cervello del Mouse tramite Laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Scopri la localizzazione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina nelle cellule di mammiferi tramite imaging quantitativo con tag fluorescenti pH-sensibili. Questo metodo consente di distinguere l'espressione di membrana da quella intracellulare con alta risoluzione.

Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dellacetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi (Video) | JoVE Journal

Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dell'acetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi

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