Generazione di un modello basato su organoidi prostatici di topo per studiare le interazioni ospite-patogeno
27 febbraio 2026
Questo protocollo descrive la generazione di un modello murino basato su organoidi prostatici coltivato in 2D. Include dissociazione organoide, semina cellulare, differenziazione, valutazione dell'integrità epiteliale e infezione in vitro con Escherichia coli uropatogeno. Il modello offre accessibilità apicale ed è adatto allo studio delle interazioni ospite-patogeno, superando le limitazioni dei tradizionali sistemi organoidi 3D.
Questa ricerca si concentra sulla comprensione di come i batteri patogeni infettino l'epitelio della prostata e quali interazioni ospite-patogeno determinano l'esito dell'infezione. I modelli in vitro esistenti catturavano scarsamente la diversità epiteliale prostatica. Questo modello fornisce un sistema fisiologicamente rilevante che riflette i diversi tipi cellulari presenti nel tessuto.
Per cominciare, si ottengono organoidi prostatici murini tridimensionali coltivati su gocce di matrice extracellulare in una piastra a 24 pozzi. Aspirare il mezzo dal numero desiderato di pozzi e aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura fresca a ciascun pozzo. L'uso di una pipetta P 1000 interrompe meccanicamente la caduta della matrice extracellulare in ciascun pozzo.
Raccogliere questa sospensione in un tubo conico da 15 millilitri con non più di due pozzi raccolti per tubo. Aggiungi un mezzo di coltura fresco per portare il volume a 10 millilitri. Inverti delicatamente il tubo tre o quattro volte per mescolarlo e centrifugare a 450 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspira il soprandante. Risospendere la pellet in due millilitri di soluzione enzimatica, preriscaldare a 37 gradi Celsius e incubare la sospensione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Utilizzando una pipetta P 1000, mescola la sospensione cellulare ogni cinque minuti durante l'incubazione.
Dopo l'incubazione, aggiungere un substrato di coltura fresco per raggiungere un volume finale di 10 millilitri. Inverti delicatamente il tubo tre o quattro volte per mescolarlo. Centrifuga a 450 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspira il sovrandanante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 300 microlitri di mezzo di coltura integrato con 10 inibitori di roccia micromolari. Utilizzando una camera di conteggio di Neubauer, conta le cellule nella sospensione.
Diluire la sospensione a una concentrazione di 62.500 cellule per millilitro in un mezzo colturale integrato con inibitori di roccia a 10 micromolari. Poi semina 200 microlitri di sospensione per pozzo per una piastra da 48 pozzi e 300 microlitri per pozzo per microvedi camerati. Incubare le piastre in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Dopo un giorno, verifica se la maggior parte delle singole cellule si è attaccata alla superficie bidimensionale della coltura. Sostituire il mezzo di coltura ogni due o tre giorni e continuare la coltura fino a raggiungere la confluenza entro sette giorni. Per indurre la differenziazione e arricchire le cellule luminali, aggiungere 10 nanomolari di cinque alfa diidrotestosterone o DHT alla sospensione cellulare durante la semina.
Strisciare il ceppo uropatogeno di Escherichia coli, o UPEC, su una piastra agar LB integrata con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Utilizzando un anello sterile, inoculare tre millilitri di brodo LB integrati con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina con una singola colonia batterica.
Incubare la coltura staticamente a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. Vortice la coltura batterica notturna. Misura la densità ottica della coltura a 600 nanometri.
Poi, calcola il volume di coltura necessario per raggiungere una densità ottica iniziale di 0,05 in tre millilitri di brodo. Aggiungi il volume calcolato di coltura batterica al brodo fresco di LB integrato con ampicillina. Incubare staticamente a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Dopo l'incubazione, si vortizza la coltura batterica. Misura la densità ottica a 600 nanometri. Calcola il volume di coltura necessario per raggiungere una densità ottica di uno.
Centrifugare il volume richiesto a 12.000 G per due minuti a temperatura ambiente. Aspira e scarta il soprantantante. Risospezione del pellet batterico in un millilitro di Primus e libero mezzo di coltura organoide senza DHT.
Successivamente, diluire la sospensione con un mezzo di coltura organoide prostatica di topo per ottenere una molteplicità di infezione di 100. Aspirare il mezzo di coltura dal modello preparato a base di organoidi. Aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura contenente batteri in ogni pozzo di una piastra da 48 pozzi.
Incubare per un'ora in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Aspirare i batteri contenenti il substrato dai pozzi e lavare i pozzi tre volte con un mezzo di coltura fresco per rimuovere i batteri extracellulari. Successivamente, aggiungi un mezzo di coltura contenente 50 microgrammi per millilitro di gentamicina e incuba per 30 minuti.
Aspira il substrato. Aggiungere un mezzo di coltura fresco, integrato con 10 microgrammi per millilitro di gentamicina per il tempo rimanente di infezione. Utilizzare un microscopio confocale per visualizzare le cellule infette dopo la colorazione fluorescente e quantificare le cellule infette utilizzando un citometro a flusso.
Nella condizione di controllo senza diidrotestosterone, la maggior parte delle cellule presentava citocheratina, cinque cellule basali positive, con solo poche che che mostravano bassa espressione luminale CD24 8. L'integrazione con un nanomolare di DHT ha prodotto popolazioni basali luminali miste, anche se il CD 24A è rimasto basso. L'aumento della DHT a 10 nanomolari ha promosso la differenziazione nelle cellule luminali, mantenendo alcune cellule basali dopo sette giorni di coltura.
Questo è correlato con gli studi di quantificazione che mostrano una diminuzione della citocheratina a cinque cellule basali positive e un aumento delle cellule luminali positive a CD 24A con l'aumento della concentrazione di DHT nel tempo. A zero ore dall'infezione, UPEC ha aderito alle cellule epiteliali in gran numero. Dopo un trattamento con gentamicina durato un'ora, il numero di cellule positive all'UPEC è diminuito drasticamente.
A 24 ore, il numero di cellule infette era simile a quello di un'ora. L'imaging confocale a 24 ore ha mostrato che i batteri intracellulari continuavano a replicarsi formando gruppi simili a comunità. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare la dinamica delle infezioni batteriche e le interazioni patogene in un modello che preserva la diversità cellulare epiteliale.
Studi futuri possono utilizzare questo modello per indagare diverse malattie della prostata, incluse infezioni, biologia del cancro e testare potenziali composti terapeutici.
Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo dettagliato per la generazione di un modello di coltura bidimensionale (2D) derivato da organoidi prostatici di topo. Il modello mantiene caratteristiche epiteliali fondamentali e consente un accesso diretto alla superficie apicale, permettendo studi approfonditi sulle interazioni ospite-patogeno, in particolare con Escherichia coli uropatogeni (UPEC). Il protocollo comprende la dissociazione degli organoidi, il seminamento cellulare, la differenziazione e le procedure di infezione, validate mediante saggi di immunofluorescenza e saggi funzionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia epiteliale della prostata
- Interazioni ospite-patogeno
- Modelli di colture cellulari e organoidi
Sfondo
- Le malattie della prostata, come l'iperplasia prostatica benigna, la prostatite e il cancro della prostata, sono comuni negli uomini in età avanzata.
- I modelli organoidi riproducono la struttura e la funzione dell'epitelio, ma limitano l'accesso alla superficie apicale.
- I modelli in vitro esistenti non riescono a catturare appieno la diversità delle cellule epiteliali prostatiche.
- Sono necessari modelli migliorati per studiare la dinamica delle infezioni e i meccanismi delle malattie.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema di coltura 2D fisiologicamente rilevante a partire da organoidi prostatici murini.
- Consentire un accesso sperimentale diretto alla superficie apicale per studi di infezione.
- Convalidare la diversità epiteliale del modello e la sua idoneità per la ricerca sulle interazioni ospite-patogeno.
Metodi Utilizzati
- Dissociazione di organoidi prostatici maturi di topo coltivati in matrice extracellulare.
- Seeding delle cellule dissociate su superfici di coltura in 2D con condizioni ottimizzate per l'attacco e la proliferazione.
- Induzione della differenziazione mediante integrazione con diidrotestosterone (DHT).
- Infezione del modello in 2D con UPEC e analisi mediante microscopia a immunofluorescenza, misurazioni di TEER e citometria a flusso.
Risultati principali
- Il modello 2D ha mantenuto le caratteristiche essenziali dell'epitelio e la diversità cellulare.
- La supplementazione con DHT ha modulato l'equilibrio tra le popolazioni di cellule basali e luminari.
- UPEC si è legato e invaso le cellule epiteliali, formando aggregati intracellulari osservati mediante microscopia confocale.
- Il trattamento con gentamicina ha ridotto efficacemente i batteri extracellulari, permettendo lo studio della dinamica dell'infezione intracellulare.
Conclusioni
- Il modello derivato da organoidi 2D fornisce una piattaforma solida per lo studio della biologia epiteliale prostatica e delle interazioni ospite-patogeno.
- Permette un'analisi dettagliata della dinamica infettiva e delle risposte cellulari.
- Il modello è adatto per futuri studi sulle malattie prostatiche e per la sperimentazione terapeutica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale per gli Esperti
I modelli 2D derivati da organoidi prostatici colmano una lacuna fondamentale nella ricerca preclinica, consentendo un'analisi diretta delle interazioni ospite-patogeno alla barriera epiteliale. Questo sistema mantiene la diversità cellulare e la funzione di barriera, offrendo un'elevata affidabilità predittiva nella validazione precoce di bersagli e nella riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca su infezioni e malattie prostatiche. La rilevanza traslazionale della piattaforma ne fa un asset riutilizzabile per la valutazione a livello di portafoglio di meccanismi patologici e strategie terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi meccanicistica delle risposte epiteliali all'infezione da Escherichia coli uropatogeno.
- Consente la validazione funzionale di bersagli delle interazioni ospite-patogeno in un contesto fisiologicamente rilevante.
- Facilita la riduzione del rischio biologico modellando sia le popolazioni cellulari basali che luminari.
- Migliora l'affidabilità predittiva per studi successivi di biologia delle infezioni.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema epiteliale standardizzato e riproducibile in 2D per saggi quantitativi di infezione.
- Permette l'accesso diretto alla superficie apicale per l'applicazione di composti o patogeni.
- Consente letture basate sulla resistenza transepiteliale (TEER) e sull'immunofluorescenza per valutare l'integrità della barriera e la differenziazione cellulare.
- Permette una preparazione scalabile per lo screening ad alto contenuto di agenti che modulano l'infezione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea alla biologia epiteliale rilevante per le malattie, per modelli traslazionali di infezione e malattie prostatiche.
- Mantiene un percorso continuo dalla scoperta alla validazione preclinica dei meccanismi ospite-patogeno.
- Permette un avanzamento delle ipotesi terapeutiche mirate ai percorsi di infezione epiteliale, adeguato al rischio.
- Consente la valutazione di interventi sperimentali in un sistema che riflette la diversità cellulare in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello bidimensionale basato su organoidi collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica sulle infezioni, consentendo la verifica di ipotesi, la validazione di bersagli e letture quantitative all'interno di un flusso di lavoro unificato.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica dell'ipotesi nulla riguardo ai meccanismi di infezione e alle risposte epiteliali.
- Screening: Fornisce saggi riproducibili e quantitativi di infezione e funzione di barriera per la valutazione di composti.
- Analisi: Offre risultati di immunofluorescenza, TEER e citometria a flusso per confronti robusti tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Mantiene un'organizzazione cellulare rilevante per la malattia, garantendo continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per diversi studi sulle malattie prostatiche e sulle infezioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella biologia delle infezioni.
- Valore operativo: Standardizza i saggi di infezione epiteliale con flussi di lavoro scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go e una selezione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta in base al rischio dei programmi su infezioni e malattie prostatiche.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella coltura di organoidi, nella differenziazione epiteliale e nei saggi di infezione.
- Necessita dell'accesso a microscopia a fluorescenza, strumentazione per la misurazione della resistenza transepiteliale (TEER) e citometria a flusso.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di semina cellulare, differenziazione e infezione.
- Adattabile ad altri modelli epiteliali mediante ottimizzazione del protocollo per specificità tissutali.
- La funzione di barriera e la diversità cellulare devono essere validate per ogni lotto sperimentale.
Domande frequenti sul biotecnologico farmaceutico
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
