Generazione di un modello basato su organoidi prostatici di topo per studiare le interazioni ospite-patogeno
February 27th, 2026
Questo protocollo descrive la generazione di un modello murino basato su organoidi prostatici coltivato in 2D. Include dissociazione organoide, semina cellulare, differenziazione, valutazione dell'integrità epiteliale e infezione in vitro con Escherichia coli uropatogeno. Il modello offre accessibilità apicale ed è adatto allo studio delle interazioni ospite-patogeno, superando le limitazioni dei tradizionali sistemi organoidi 3D.
Questa ricerca si concentra sulla comprensione di come i batteri patogeni infettino l'epitelio della prostata e quali interazioni ospite-patogeno determinano l'esito dell'infezione. I modelli in vitro esistenti catturavano scarsamente la diversità epiteliale prostatica. Questo modello fornisce un sistema fisiologicamente rilevante che riflette i diversi tipi cellulari presenti nel tessuto.
Per cominciare, si ottengono organoidi prostatici murini tridimensionali coltivati su gocce di matrice extracellulare in una piastra a 24 pozzi. Aspirare il mezzo dal numero desiderato di pozzi e aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura fresca a ciascun pozzo. L'uso di una pipetta P 1000 interrompe meccanicamente la caduta della matrice extracellulare in ciascun pozzo.
Raccogliere questa sospensione in un tubo conico da 15 millilitri con non più di due pozzi raccolti per tubo. Aggiungi un mezzo di coltura fresco per portare il volume a 10 millilitri. Inverti delicatamente il tubo tre o quattro volte per mescolarlo e centrifugare a 450 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspira il soprandante. Risospendere la pellet in due millilitri di soluzione enzimatica, preriscaldare a 37 gradi Celsius e incubare la sospensione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Utilizzando una pipetta P 1000, mescola la sospensione cellulare ogni cinque minuti durante l'incubazione.
Dopo l'incubazione, aggiungere un substrato di coltura fresco per raggiungere un volume finale di 10 millilitri. Inverti delicatamente il tubo tre o quattro volte per mescolarlo. Centrifuga a 450 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspira il sovrandanante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 300 microlitri di mezzo di coltura integrato con 10 inibitori di roccia micromolari. Utilizzando una camera di conteggio di Neubauer, conta le cellule nella sospensione.
Diluire la sospensione a una concentrazione di 62.500 cellule per millilitro in un mezzo colturale integrato con inibitori di roccia a 10 micromolari. Poi semina 200 microlitri di sospensione per pozzo per una piastra da 48 pozzi e 300 microlitri per pozzo per microvedi camerati. Incubare le piastre in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Dopo un giorno, verifica se la maggior parte delle singole cellule si è attaccata alla superficie bidimensionale della coltura. Sostituire il mezzo di coltura ogni due o tre giorni e continuare la coltura fino a raggiungere la confluenza entro sette giorni. Per indurre la differenziazione e arricchire le cellule luminali, aggiungere 10 nanomolari di cinque alfa diidrotestosterone o DHT alla sospensione cellulare durante la semina.
Strisciare il ceppo uropatogeno di Escherichia coli, o UPEC, su una piastra agar LB integrata con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Utilizzando un anello sterile, inoculare tre millilitri di brodo LB integrati con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina con una singola colonia batterica.
Incubare la coltura staticamente a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. Vortice la coltura batterica notturna. Misura la densità ottica della coltura a 600 nanometri.
Poi, calcola il volume di coltura necessario per raggiungere una densità ottica iniziale di 0,05 in tre millilitri di brodo. Aggiungi il volume calcolato di coltura batterica al brodo fresco di LB integrato con ampicillina. Incubare staticamente a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Dopo l'incubazione, si vortizza la coltura batterica. Misura la densità ottica a 600 nanometri. Calcola il volume di coltura necessario per raggiungere una densità ottica di uno.
Centrifugare il volume richiesto a 12.000 G per due minuti a temperatura ambiente. Aspira e scarta il soprantantante. Risospezione del pellet batterico in un millilitro di Primus e libero mezzo di coltura organoide senza DHT.
Successivamente, diluire la sospensione con un mezzo di coltura organoide prostatica di topo per ottenere una molteplicità di infezione di 100. Aspirare il mezzo di coltura dal modello preparato a base di organoidi. Aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura contenente batteri in ogni pozzo di una piastra da 48 pozzi.
Incubare per un'ora in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Aspirare i batteri contenenti il substrato dai pozzi e lavare i pozzi tre volte con un mezzo di coltura fresco per rimuovere i batteri extracellulari. Successivamente, aggiungi un mezzo di coltura contenente 50 microgrammi per millilitro di gentamicina e incuba per 30 minuti.
Aspira il substrato. Aggiungere un mezzo di coltura fresco, integrato con 10 microgrammi per millilitro di gentamicina per il tempo rimanente di infezione. Utilizzare un microscopio confocale per visualizzare le cellule infette dopo la colorazione fluorescente e quantificare le cellule infette utilizzando un citometro a flusso.
Nella condizione di controllo senza diidrotestosterone, la maggior parte delle cellule presentava citocheratina, cinque cellule basali positive, con solo poche che che mostravano bassa espressione luminale CD24 8. L'integrazione con un nanomolare di DHT ha prodotto popolazioni basali luminali miste, anche se il CD 24A è rimasto basso. L'aumento della DHT a 10 nanomolari ha promosso la differenziazione nelle cellule luminali, mantenendo alcune cellule basali dopo sette giorni di coltura.
Questo è correlato con gli studi di quantificazione che mostrano una diminuzione della citocheratina a cinque cellule basali positive e un aumento delle cellule luminali positive a CD 24A con l'aumento della concentrazione di DHT nel tempo. A zero ore dall'infezione, UPEC ha aderito alle cellule epiteliali in gran numero. Dopo un trattamento con gentamicina durato un'ora, il numero di cellule positive all'UPEC è diminuito drasticamente.
A 24 ore, il numero di cellule infette era simile a quello di un'ora. L'imaging confocale a 24 ore ha mostrato che i batteri intracellulari continuavano a replicarsi formando gruppi simili a comunità. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare la dinamica delle infezioni batteriche e le interazioni patogene in un modello che preserva la diversità cellulare epiteliale.
Studi futuri possono utilizzare questo modello per indagare diverse malattie della prostata, incluse infezioni, biologia del cancro e testare potenziali composti terapeutici.
Overview
This article presents a step-by-step protocol for generating a two-dimensional (2D) culture model derived from mouse prostate organoids. The model maintains key epithelial characteristics and allows direct access to the apical surface, enabling detailed studies of host-pathogen interactions, particularly with uropathogenic Escherichia coli (UPEC). The protocol includes organoid dissociation, cell seeding, differentiation, and infection procedures, validated by immunofluorescence and functional assays.
Key Study Components
Area of Science
- Prostate epithelial biology
- Host-pathogen interactions
- Organoid and cell culture models
Background
- Prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia, prostatitis, and prostate cancer are prevalent in aging men.
- Organoid models replicate epithelial structure and function but limit access to the apical surface.
- Existing in vitro models do not fully capture the diversity of prostatic epithelial cells.
- Improved models are needed to study infection dynamics and disease mechanisms.
Purpose of Study
- To develop a physiologically relevant 2D culture system from mouse prostate organoids.
- To enable direct experimental access to the apical surface for infection studies.
- To validate the model's epithelial diversity and suitability for host-pathogen interaction research.
Methods Used
- Dissociation of mature mouse prostate organoids cultured in extracellular matrix.
- Seeding of dissociated cells onto 2D culture surfaces with optimized conditions for attachment and proliferation.
- Differentiation induction using dihydrotestosterone (DHT) supplementation.
- Infection of the 2D model with UPEC and analysis via immunofluorescence microscopy, TEER measurements, and flow cytometry.
Main Results
- The 2D model retained essential epithelial characteristics and cellular diversity.
- DHT supplementation modulated the balance between basal and luminal cell populations.
- UPEC adhered to and invaded epithelial cells, forming intracellular clusters observed by confocal microscopy.
- Gentamycin treatment effectively reduced extracellular bacteria, allowing study of intracellular infection dynamics.
Conclusions
- The 2D organoid-derived model provides a robust platform for studying prostate epithelial biology and host-pathogen interactions.
- It enables detailed investigation of infection dynamics and cellular responses.
- The model is suitable for future studies on prostate diseases and therapeutic testing.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Prostate organoid-derived 2D models address a critical gap in preclinical research by enabling direct interrogation of host-pathogen interactions at the epithelial barrier. This system preserves cellular diversity and barrier function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for infection and prostate disease research. The platform's translational relevance positions it as a reusable asset for portfolio-wide evaluation of disease mechanisms and therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial responses to uropathogenic Escherichia coli infection.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a physiologically relevant context.
- Facilitates biological de-risking by modeling both basal and luminal cell populations.
- Improves predictive confidence for downstream infection biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible 2D epithelial system for quantitative infection assays.
- Enables direct access to the apical surface for compound or pathogen application.
- Supports TEER and immunofluorescence-based readouts for barrier integrity and cell differentiation.
- Allows scalable preparation for high-content screening of infection-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant epithelial biology for translational infection and prostate disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of host-pathogen mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting epithelial infection pathways.
- Supports evaluation of candidate interventions in a system reflecting in vivo cellular diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid-based 2D model bridges early discovery and preclinical infection research, enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative readouts within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of infection mechanisms and epithelial responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection and barrier function assays for compound evaluation.
- Analytics: Provides immunofluorescence, TEER, and flow cytometry outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular organization for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse prostate disease and infection studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes epithelial infection assays with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of infection and prostate disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, epithelial differentiation, and infection assays.
- Needs access to immunofluorescence microscopy, TEER instrumentation, and flow cytometry.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, differentiation, and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial models with protocol optimization for tissue specificity.
- Barrier function and cellular diversity must be validated for each experimental batch.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
