Indagine di un dispositivo LED a luce blu per sopprimere patogeni delle ferite utilizzando un modello cutaneo sintetico a base di collagene

La nostra ricerca indaga come una luce blu di 405 nanometri possa sopprimere in sicurezza i patogeni delle ferite utilizzando un modello cutaneo sintetico a base di collagene. La maggior parte degli studi utilizza colture di brodo, piastre di agar o modelli animali. Introduciamo una piattaforma realistica e riproducibile che imita la pelle per i test fototerapeutici.

Per cominciare, ottenere i ceppi batterici e fungini desiderati. Scegli una singola colonia isolata e inoculala asetticamente in cinque millilitri di brodo di soia triptico. Una volta che tutti i ceppi sono stati inoculati, incubare le colture.

Dopo il tempo di incubazione desiderato, si regola la torbidità utilizzando PBS sterile allo standard di McFarland 0,5 per i test antimicrobici. Successivamente, prelevare sezioni di pelle sintetica idratata a base di collagene preparate e inoculare ogni sezione con 100 microlitri di sospensione microbica. Utilizzando uno spreader sterile, distribuire la sospensione uniformemente sulla superficie.

Poi asciugare all'aria i campioni inoculati in una camera sterile in condizioni ambientali. Assegnare i campioni a tre gruppi di trattamento per variare l'esposizione alla luce. Per l'irradiazione, monta il dispositivo LED a luce blu su un dissipatore di calore in alluminio.

Utilizzare un misuratore di potenza ottica calibrato per misurare l'irradianza al piano di trattamento esatto. Regola l'altezza della sonda per tenere conto dello spessore del sensore. Ora regola la distanza di scarico del LED per standardizzare l'irradianza di lavoro a 30 milliwatt per centimetro quadrato.

Posiziona asepticamente i campioni di pelle inoculati del gruppo B in piastre di Petri sterili senza coperchio. Posizionare le parabole direttamente sotto il LED della luce blu e irradiare per 15 minuti per ottenere una fluenza target di 27 joule per centimetro quadrato. Analogamente, irradia il gruppo C sotto luce UVC per due minuti per ottenere una fluenza target di 3,6 joule per centimetro quadrato.

Dopo l'irradiazione, trasferire il campione di pelle sintetica trattata in un tubo sterile da 15 millilitri contenente nove millilitri di PBS a pH 7,4 e vorticerlo delicatamente per spostare i microbi che aderiscono alla superficie. Ora prepara diluizioni seriali dieci volte più numerose della sospensione. Placca 100 microlitri delle diluizioni selezionate sulle piastre di agar e incuba le piastre.

Al termine del periodo di incubazione, si contano il numero di colonie e si registrano le unità che formano colonie. Calcola la riduzione microbica utilizzando le equazioni presentate. Per simulare l'esposizione aerea nosocomiale, si utilizza una camera aerosol acrilica personalizzata in condizioni ambientali controllate.

Posizionare placche di agar sterili all'interno della camera per monitorare l'attività delle ricadute microbiche. Poi posiziona i campioni di pelle sterili all'interno della camera. Utilizzando un nebulizzatore, aerosolizza due millilitri di sospensione microbica nella camera ed espone i campioni a luce blu continua a 10 microwatt per centimetro quadrato da una distanza di 20 centimetri per 30 minuti.

Per il controllo, ripetere condizioni identiche della camera con il dispositivo a luce blu spento. Quantificare i conteggi validi dagli swatch tramite l'analisi standard del conteggio delle lastre. Per l'analisi FTIR, ottieni campioni di pelle sintetica e idratali secondo le istruzioni del produttore.

Dividere i campioni idratati in quattro set su una superficie sterile. Esporre due serie di campioni a luce blu di 405 nanometri con un'intensità di 30 milliwatt per centimetro quadrato. Esponi un set per 15 minuti e l'altro per 60 minuti.

Allo stesso modo, esponi due serie di campioni a luce UVC di 265 nanometri con un'intensità di tre milliwatt per centimetro quadrato, con un set esposto per 15 minuti e l'altro per 60 minuti. Dopo l'irradiazione, tampona delicatamente i campioni per rimuovere l'umidità superficiale. Analizza i campioni utilizzando la spettroscopia FTIR per valutare i cambiamenti chimici e strutturali.

Configurare lo strumento FTIR in modalità ATR e preparare la superficie cristallina per la collocazione del campione. Posiziona il campione sul cristallo ATR per l'acquisizione spettrale. Effettuare confronti spettrali diretti tra campioni di controllo non trattati e irradiati.

Successivamente, utilizzare il campione di controllo non trattato come riferimento di fondo e scansionare i campioni irradiati per ottenere spettri sottratti di base. Il dispositivo LED a luce blu ha dimostrato una significativa efficacia antimicrobica contro tutti i patogeni delle ferite testati su modelli cutanei sintetici. Le riduzioni medie dei logari rivelano differenze di suscettibilità dipendenti dalla specie, con Klebsiella pneumoniae che ha mostrato la maggiore sensibilità alla luce blu e Staphylococcus aureus una riduzione relativamente inferiore, sebbene comunque significativa.

L'irradiazione UVC ha raggiunto riduzioni microbiche più elevate su tutte le specie testate. L'irradiazione da luce blu e UVC ha dimostrato un'attività antimicrobica ad ampio spettro contro patogeni batterici clinicamente rilevanti, tra cui Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans. L'esposizione alla luce blu ha causato una riduzione dipendente dal tempo di tutti e tre i patogeni della ferita, con Escherichia coli e Candida albicans che si sono inattivati rapidamente, e Staphylococcus aureus che ha mostrato un declino progressivo più lento.

L'efficacia della luce blu è stata ulteriormente valutata in condizioni simulate di contaminazione aerea. L'esposizione continua ha significativamente ridotto la deposizione microbica sulle superfici cutanee sintetiche rispetto ai controlli non trattati per ogni specie valutata. Gli spettri ATR-FTIR corretti di base indicarono che il trattamento UVC riduceva l'intensità dei picchi ammidi e aumentava le vibrazioni di allungamento carbonio-ossigeno, riflettendo la decomposizione del collagene.

Al contrario, l'esposizione alla luce blu non ha indotto cambiamenti spettrali o chimici significativi. Questo metodo valuta le fonti luminose di fototerapia testando l'efficacia antimicrobica preservando l'integrità e la sicurezza del collagene su superfici simili alla pelle. La sfida principale di questo protocollo è mantenere un'irradianza uniforme e un controllo accurato della fluenza delle sorgenti luminose per garantire risultati antimicrobici riproducibili.

Questo protocollo può essere esteso a test biofilm, analisi dello stress ossidativo, ottimizzazione di dispositivi luminosi di nuova generazione e screening di interventi terapeutici simili e innovativi.