Una semplice tecnica di microaspirazione per isolare cellule somatiche da sperma equino criopreservato come donatori nucleari per la clonazione
19 dicembre 2025
Questo protocollo presenta una semplice tecnica di microaspirazione per isolare cellule somatiche (SC) vitali dal seme equino criopriservato. A differenza degli approcci tradizionali, questa tecnica evita lunghe colture in vitro e supera la contaminazione da spermatozoi, consentendo un uso immediato nella clonazione delle cellule somatiche.
Miriamo a dimostrare che le cellule somatiche provenienti da sperma equino criopreservato possono essere utili per recuperare individui di alto valore genetico. La nostra sfida attuale è poter selezionare cellule somatiche con DNA diploide intatto da utilizzare come donatore nucleare. Per cominciare, rimuovi le cannucce di sperma equina dalla vasca di azoto liquido.
Esponi l'aria per 10 secondi e scongelali in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 secondi. Prendi un campione di 250 microlitri dello sperma scongelato. Diluisci con un millilitro di medium DMEM-F12 integrato.
Incuba la miscela di sperma a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Pipetta 25 microlitri dalla diluizione incubata in un tubetto e diluisci in 975 microlitri di DPBS integrato con 0,1 milligrammi per millilitro di alcol polivinilico o polivinil pirrolidone. Mescola delicatamente la sospensione.
Mantieni la miscela di sperma diluita a 37 gradi Celsius per tutto il processo di raccolta cellulare. Posizionare un coperchio per piastre di Petri contenente sperma equino diluito sul palco del microscopio per prepararlo alla raccolta delle cellule somatiche. Seleziona una micropipetta di diametro adeguato per la raccolta delle cellule somatiche e collegala al sistema meccanico di aspirazione.
Inserisci con cura la micropipetta nel micro drop e allineala alla base del coperchio della piatta. Una volta aspirata la pipetta del mezzo di coltura, inizia la cattura individuale delle cellule somatiche. Concentrati sul fondo del micro drop, dove sono visibili varie morfologie cellulari.
Posiziona la punta della micropipetta accanto a ciascuna cellula somatica e aspira sotto pressione negativa. Raccogli tutte le cellule rotonde ed allungate, indipendentemente dalla dimensione. Dopo aver raccolto 10 cellule, depositale in una microgoccia da 10 microlitri situata sulla superficie superiore del coperchio della piatta.
Trattieni tutte le cellule somatiche raccolte all'interno di questo micro drop durante tutto il processo di raccolta. Una volta raccolto il numero desiderato di cellule somatiche, esegui una semplice procedura di lavaggio utilizzando microgocce per rimuovere spermatozoi, detriti e contaminanti microbici. Utilizzando un secondo coperchio per piatti, esegui un lavaggio sequenziale in tre fasi delle cellule somatiche.
Usa una micropipetta per trasferire le cellule somatiche nella prima goccia e lasciale sedimentare per tre o cinque minuti. Trasferire le cellule dalla prima goccia alla seconda goccia seguendo la stessa procedura. Ripeti il trasferimento ancora una volta e inserisci le cellule somatiche nella terza goccia.
Infine, depositare le cellule somatiche isolate in una microgoccia preparata designata per il trasferimento nucleare delle cellule somatiche. La tecnica di microaspirazione ha recuperato con successo cellule somatiche da sperma equino criopriservato, con tassi di cattura che variano da 317,7 a 424,7 cellule all'ora su tre stalloni. Lo stallone numero 3 mostra la resa più alta.
Sono stati identificati cinque tipi distinti di cellule somatiche in base a dimensioni e morfologia. Abbiamo identificato una popolazione di cellule somatiche che differisce per morfologia e vitalità nello sperma equino criopreservato, che potrebbe essere utile come donatore nucleare. Le cellule possono essere selezionate in base alla loro morfologia e la procedura non richiede l'istituzione di una coltura primaria.
Ci concentreremo sul miglioramento della vitalità di queste cellule dopo l'aumento della massa dello sperma equino.
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Panoramica
Questo protocollo presenta una tecnica di microaspirazione per isolare cellule somatiche vitali da sperma equino criopreservato. Questo metodo evita colture in vitro prolungate e contaminazioni da spermatozoi, consentendo un uso immediato nella clonazione di cellule somatiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia della riproduzione
Contesto
- Le cellule somatiche possono essere derivate da sperma equino criopreservato.
- L'isolamento di cellule somatiche vitali è fondamentale ai fini della clonazione.
- I metodi tradizionali prevedono spesso tempi di coltura prolungati.
- La contaminazione da spermatozoi può ostacolare il processo di clonazione.
Scopo dello studio
- Dimostrare una tecnica per isolare cellule somatiche dal seme equino.
- Permettere l'utilizzo di queste cellule per la clonazione di individui con elevato valore genetico.
- Assicurare che le cellule somatiche selezionate abbiano un DNA diploide integro.
Metodi Utilizzati
- Scongelamento delle cannule di sperma equino dall'azoto liquido.
- Utilizzo di un bagnomaria a 37 gradi Celsius per lo scongelamento.
- Campionamento e diluizione dello sperma scongelato con mezzo DMEM-F12 supplementato.
- Applicazione di una tecnica di microaspirazione per l'isolamento delle cellule.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule somatiche vitali.
- Riduzione della contaminazione da spermatozoi nel processo.
- Utilizzabilità immediata delle cellule isolate per il clonaggio.
- Preservazione dell'integrità del DNA diploide nelle cellule selezionate.
Conclusioni
- La tecnica di microaspirazione è efficace per l'isolamento di cellule somatiche.
- Questo metodo aumenta il potenziale per il clonaggio di cellule somatiche negli equini.
- Applicazioni future potrebbero portare a un miglioramento del recupero genetico nell'allevamento equino.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il recupero efficiente di cellule somatiche vitali da sperma equino criopreservato affronta un collo di bottiglia fondamentale nell'utilizzo delle risorse genetiche per tecnologie riproduttive avanzate. Questa tecnica di microaspirazione consente un accesso immediato a cellule donatrici diploidi per il trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT), eliminando la necessità di colture prolungate e riducendo al minimo la contaminazione da spermatozoi. L'approccio amplia il potenziale per il recupero genetico e la diversificazione del portafoglio nei processi biotecnologici animali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Permette l'analisi diretta della vitalità delle cellule somatiche e dello stato diploide da campioni criopreservati.
- Consente la validazione funzionale dell'idoneità del nucleo donatore per flussi di lavoro di trasferimento nucleare da cellule somatiche (SCNT).
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici permettendo la selezione morfologica delle cellule donatrici.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un metodo rapido e riproducibile per isolare cellule somatiche libere da interferenze dello sperma.
- Fornisce popolazioni cellulari standardizzate per saggi di clonazione successivi, senza necessità di stabilire colture primarie.
- Consente una valutazione quantitativa del rendimento cellulare e della morfologia ai fini dell'ottimizzazione del processo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Migliora la continuità dal banking delle risorse genetiche alle applicazioni precliniche di clonazione.
- Si allinea agli obiettivi traslazionali consentendo il recupero di genotipi ad alto valore da materiale conservato.
- Riduce il rischio biologico assicurando l'integrità delle cellule donatrici prima della generazione dell'embrione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di microaspirazione si integra all'interfaccia tra il recupero delle risorse genetiche e il clonaggio basato sulla SCNT, collegando la banca di criopreservazione con la preparazione immediata del donatore nucleare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla vitalità delle cellule donatrici e sull'integrità genetica a partire da fonti criopreservate.
- Screening: Standardizza l'isolamento di cellule somatiche per un input riproducibile nella SCNT.
- Analisi: Consente la misurazione quantitativa del rendimento cellulare e della diversità morfologica.
- Ricerca traslazionale: Collega il seme biobancato a flussi di lavoro di clonazione applicabili per il recupero genetico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per diversi background genetici e campioni archiviati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nell'idoneità delle cellule donatrici e riduce l'ambiguità meccanicistica nella SCNT.
- Valore operativo: Semplifica l'isolamento cellulare, migliora la riproducibilità ed elimina i lunghi passaggi di coltura.
- Valore strategico: Consente decisioni rapide di tipo go/no-go per progetti di recupero genetico e ottimizza l'allocazione delle risorse.
- Impatto sul portafoglio: Amplia la gamma di materiale genetico utilizzabile per il clonaggio e per strategie di allevamento con rischio aggiustato.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in micromanipolazione e valutazione della morfologia cellulare.
- Necessita dell'accesso a sistemi di aspirazione meccanica e a infrastrutture microscopiche.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di selezione e lavaggio delle cellule.
- È adattabile a diversi campioni di sperma, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per specie diverse o per diverse condizioni di conservazione.
- La viabilità cellulare dopo l'isolamento può variare e deve essere monitorata per verificare la prontezza alla SCNT.
