Una semplice tecnica di microaspirazione per isolare cellule somatiche da sperma equino criopreservato come donatori nucleari per la clonazione

Miriamo a dimostrare che le cellule somatiche provenienti da sperma equino criopreservato possono essere utili per recuperare individui di alto valore genetico. La nostra sfida attuale è poter selezionare cellule somatiche con DNA diploide intatto da utilizzare come donatore nucleare. Per cominciare, rimuovi le cannucce di sperma equina dalla vasca di azoto liquido.

Esponi l'aria per 10 secondi e scongelali in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 secondi. Prendi un campione di 250 microlitri dello sperma scongelato. Diluisci con un millilitro di medium DMEM-F12 integrato.

Incuba la miscela di sperma a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Pipetta 25 microlitri dalla diluizione incubata in un tubetto e diluisci in 975 microlitri di DPBS integrato con 0,1 milligrammi per millilitro di alcol polivinilico o polivinil pirrolidone. Mescola delicatamente la sospensione.

Mantieni la miscela di sperma diluita a 37 gradi Celsius per tutto il processo di raccolta cellulare. Posizionare un coperchio per piastre di Petri contenente sperma equino diluito sul palco del microscopio per prepararlo alla raccolta delle cellule somatiche. Seleziona una micropipetta di diametro adeguato per la raccolta delle cellule somatiche e collegala al sistema meccanico di aspirazione.

Inserisci con cura la micropipetta nel micro drop e allineala alla base del coperchio della piatta. Una volta aspirata la pipetta del mezzo di coltura, inizia la cattura individuale delle cellule somatiche. Concentrati sul fondo del micro drop, dove sono visibili varie morfologie cellulari.

Posiziona la punta della micropipetta accanto a ciascuna cellula somatica e aspira sotto pressione negativa. Raccogli tutte le cellule rotonde ed allungate, indipendentemente dalla dimensione. Dopo aver raccolto 10 cellule, depositale in una microgoccia da 10 microlitri situata sulla superficie superiore del coperchio della piatta.

Trattieni tutte le cellule somatiche raccolte all'interno di questo micro drop durante tutto il processo di raccolta. Una volta raccolto il numero desiderato di cellule somatiche, esegui una semplice procedura di lavaggio utilizzando microgocce per rimuovere spermatozoi, detriti e contaminanti microbici. Utilizzando un secondo coperchio per piatti, esegui un lavaggio sequenziale in tre fasi delle cellule somatiche.

Usa una micropipetta per trasferire le cellule somatiche nella prima goccia e lasciale sedimentare per tre o cinque minuti. Trasferire le cellule dalla prima goccia alla seconda goccia seguendo la stessa procedura. Ripeti il trasferimento ancora una volta e inserisci le cellule somatiche nella terza goccia.

Infine, depositare le cellule somatiche isolate in una microgoccia preparata designata per il trasferimento nucleare delle cellule somatiche. La tecnica di microaspirazione ha recuperato con successo cellule somatiche da sperma equino criopriservato, con tassi di cattura che variano da 317,7 a 424,7 cellule all'ora su tre stalloni. Lo stallone numero 3 mostra la resa più alta.

Sono stati identificati cinque tipi distinti di cellule somatiche in base a dimensioni e morfologia. Abbiamo identificato una popolazione di cellule somatiche che differisce per morfologia e vitalità nello sperma equino criopreservato, che potrebbe essere utile come donatore nucleare. Le cellule possono essere selezionate in base alla loro morfologia e la procedura non richiede l'istituzione di una coltura primaria.

Ci concentreremo sul miglioramento della vitalità di queste cellule dopo l'aumento della massa dello sperma equino.